دانشگاه فردوسی مشهد
دانشکده کشاورزی
پایان نامه کارشناسی ارشد
کلونینگ و بیان بخش‌های آنتی ژنیک سیتوتوکسین مرتبط با ژن A (CagA) هلیکو باکتر پیلوری در باکتری اشرشیا کلی و امکان سنجی تولید IgY در زرده تخم مرغ
استاد راهنما
دکتر محمد رضا نصیری
استادان مشاور
دکتر مجتبی طهمورث پور
دکتر کیارش قزوینی
شهریور 1393
(در فایل دانلودی نام نویسنده موجود است)
تکه هایی از متن پایان نامه به عنوان نمونه :
(ممکن است هنگام انتقال از فایل اصلی به داخل سایت بعضی متون به هم بریزد یا بعضی نمادها و اشکال درج نشود ولی در فایل دانلودی همه چیز مرتب و کامل است)
چکیده
هلیکوباکتر پیلوری شایع ترین پاتوژن گوارشی است که نیمی از مردم دنیا را آلوده ساخته و مهمترین علت بیماری‌های معده ای-روده ای از جمله گاستریک مزمن، زخم معده و دوازدهه، سرطان معده و لنفوما است. ژن CagA (سیتوتوکسین مرتبط با ژن A) یکی مهمترین شاخص‌های بیماری زای این باکتری است. در این مطالعه به منظور همانه سازی بخش‌های آنتی ژنیک ژن CagA و بررسی تولید IgY در زرده تخم مرغ در ابتدا بر اساس برنامه‌های بیوانفورماتیکی قطعه حاوی اپی‌توپ‌های اصلی ژن CagA به طول 996 جفت باز شناسائی شد سپس این قطعه به کمک PCR از ژنوم هلیکوباکتر پیلوری موجود در بیوپسی معده 30 بیمار مبتلا به این باکتری جدا شده و با بهره گرفتن از هضم آنزیمی به ناقل pET32a و سپس به داخل میزبان‌های کلون سازی و بیانی وارد شد. نتایج توالی یابی کلونیگ موفق ژن CagA را نشان داد و در نهایت ترکیب پروتئینی بدست آمده توسط روش SDS-PAGE و دات بلات تائید شد. در مرحله بعد ترکیب پروتئینی بدست آمده به 3 مرغ از نژاد HY-LINE تزریق شد. تخم مرغ‌ها به مدت 10 هفته جمع آوری شدند و IgY تولید شده در زرده تخم مرغ آنها با بهره گرفتن از روش SDS-PAGE بررسی و تائید شد.
کلمات کلیدی: مهندسی آنتی بادی،کیت تشخیصی، ایمنوژنتیک
| عنوان صفحه |
2-1 مکمل‌ها و غذاهای عمل گرا 5
2-1-1 تفاوت غذای عمل گرا و مکمل غذائی.. 6
2-2-1 ایمنوگلوبین زرده ی تخم مرغ (IgY). 7
2-2-3 کاربرد‌های بیوآنالایتیک… 9
2-2-4 استفاده در مواد غذائی.. 10
2-3-4 زیرواحد CagA هلیکوباکتر پیلوری.. 14
2-3-7 التهاب، ورم معده و زخم. 16
2-3-8 جزیره بیماریزائی Cag.. 17
2-3-14 بقاء هلیکوباکتر پیلوری.. 22
2-3-15 همه گیر شناسی باکتری (Epidemiology). 24
2-5-2-1 اپی توپ‌های سلول T.. 27
2-5-4 نقشه برداری اپی توپ فضائی.. 28
2-6 تحقیقات انجام شده در این زمینه. 29
2-7- 2 نرم افزار CLC Work Bench5. 38
3-1 تعیین نواحی آنتی ژنیک ژن CagA.. 40
3-2 تهیه باکتری هلیکو باکتر پیلوری.. 41
3-3 استخراج DNA و تعیین کمیت و کیفیت DNA استخراج شده 41
3-3-1 تعیین کمیت و کیفیت DNA با ژل آگارز. 41
3-4 تعیین غلظت DNA استخراج شده 42
3-7-1 بررسی بر روی ژل الکتروفورز. 45
3-8 طرز تهیه محلولهای مورد استفاده در کلونینگ… 45
3-8-2 محلول غلیظ آنتی بیوتیک آمپیسیلین.. 46
3-8-3 محلول غلیظ IPTG (0. 1M). 46
3-8-4 محلول غلیظ X-Gal (20mg/ml). 46
3-8-6 محیط کشت LB-Agar جامد. 47
3-9-3 خالص سازی pET-32a (+) و قطعه هدف… 49
3-9-4 نانودراپ محصولات خالص شده 50
3-9-5 انجام واکنش الحاق قطعه هدف ژن CagA با pET-32a (+). 50
3-9-6 جوان سازی باکتری DH5α.. 51
3-9-7 تهیه سلول‌های مستعد DH5α.. 52
3-9-8 انتقال پلاسمید نوترکیب به باکتری.. 52
3-9-9 کشت پرگنه‌‌ها و غربال گری باکتری های نوترکیب… 53
3-9-11 استخراج پلاسمید نوترکیب… 54
3-9 -12 تایید کلونیها از طریق هضم آنزیمی.. 55
3-11 انتقال پلاسمید pET-32a (+) حاوی ژن هدف به باکتری BL21 (DE3). 56
3-13 استخراج پروتئین از باکتری.. 57
3-14 الکتروفورز پروتئینها به روش SDS-PAGE. 58
3-14-1 مراحل بستن ژل به صورت زیر انجام شد: 59
3-16-1 بافر شستشو یا محلول TBS. 62
3-16-3 بافر شستشو یا محلول TBS-T.. 62
3-16-6 روش تهیه محلول رنگ آمیزی DAB.. 62
3-18 آماده سازی آنتی ژن ایمنی زا برای تزریق به مرغ. 64
3-19 ایمنی زائی مرغ‌ها جهت تولید آنتی بادی اختصاصی.. 65
3-19-2 تزریق‌های ثانویه (Booster injection). 66
3-20 جمع آوری و ذخیره تخم مرغ. 66
3-21 جداسازی IgY با بهره گرفتن از روش پلی اتیلن گلایکول 14700.. 66
3-22 بررسی IgY به روش الکتروفورز SDS-PAGE و دات بلات… 67
4-1 تعیین نواحی آنتی ژنیک ژن CagA.. 67
4-2 تایید آلودگی نمونه‌های بیوپسی.. 69
4-3 تعیین کمیت و کیفیت DNA.. 69
4-6 هضم PET32a (+) و ژن CagA.. 71
4-7 کلونینگ ژن CagA در باکتری DH5α.. 72
4-8 تأیید صحت قطعه کلونشده در pET32a (+). 73
4-10 تایید نتایج کلونی PCR با بهره گرفتن از T7. 74
4-11 استخراج پلاسمید و انجام هضم آنزیمی.. 75
4-13 آنالیز فیلوژنتیکی توالی آمینواسیدی CagA.. 76
4-18 تولید IgY ضد هلیکو باکتر پیلوری-CagA در زرده تخم مرغ. 81
فهرست شکل‌ها
| عنوان صفحه |
شکل 4-1. نتایج نرم افزار bcepred. 68
شکل 4-2. تست اوره آز انجام شده بر روی نمونه‌های بیوپسی. 69
شکل 4-3. تعیین کیفیت و کمیت DNA. 70
شکل4-5. خالص سازی محصول PCR . 71
شکل4-6. هضم ناقل بیان و قطعه هدف… 72
شکل4-7. کشت خطی از تک کلون‌های رشد کرده بر روی محیط کشت LB-آگار حاوی آمپی سیلین.. 73
شکل4-9. کلونی PCR با بهره گرفتن از پرایمر T7 و T-terminatoor. 75
شکل 4-10. استخراج پلاسمید نوترکیب و هضم آنزیمی.. 76
شکل 4-12. بررسی بیان پروتئین نوترکیب با الکتروفورزSDS-PAGE 78
شکل 4-13. دات بلات پروتئینهای استخراج شده. 79
شکل 4-14.تعیین غلظت پروتئین با بهره گرفتن از روش برادفورد. 81
شکل 4-15.خالص سازی پروتئین و حذف باند‌های غیر اختصاصی. 81
فهرست جدول‌ها
| عنوان صفحه |
جدول 3-1 مواد و مقادیر لازم برای انجام PCR یک واکنش…. 43
جدول3-2. برنامه حرارتی مورد استفاده جهت تکثیر نواحی آنتی ژنیک ژن CagA.. 44
جدول3-3 مواد مورد نیاز جهت تهیه محیط کشت LB مایع.. 46
جدول3-4 مواد مورد نیاز جهت تهیه محیط کشت جامد LB-Agar. 47
جدول 3-5 مواد و مقادیر لازم برای انجام واکنش هضم قطعه هدف ژنCagA.. 48
جدول 3-6. مواد و مقادیر لازم برای انجام واکنش هضم pET-32a (+) 49
جدول3-7. مواد مورد نیاز جهت انجام واکنش الحاق.. 50
جدول 3-8. مواد و مقادیر لازم برای انجام واکنش هضم پلاسمید pET32a (+)-CagA.. 55
جدول3-9. مواد مورد نیاز برای تهیه بافر Laemmli buffer samples 5X. 58
جدول3-10 مواد و مقادیر لازم جهت تهیه ژل پایینی SDS-PAGE. 58
جدول 3-11 مواد لازم جهت بستن ژل بالایی SDS-PAGE. 59
جدول3-12. مواد و مقادیر مورد نیاز برای بافر 5X تانک SDS-PAGE. 59
فهرست علائم و اختصارات
| معادل فارسی | معادل لاتین | علامت اختصاری |
| آدنوزین دی فسفات | Adenosine 5’-Diphosphate | ADP
|
| آدنوزین تری فسفات | Adenosine 5’-Triphosphate | ATP |
| جفت باز | Base pair | bp |
| سرم البومین گاوی | Bovain serum albumin | BSA |
| دی آمینو بنزیدین | Diamino Benzidine | DAB |
| آب دوبار تقطیر | Double Distilled Water | ddW |
| اسید دزوکسی ریبو نوکلئیک | Deoxyribonocleic Acid | DNA |
| اتیلن دیامین تترا- استیک اسید | Ethylenediaminetetra-acetic acid | EDTA |
| سازمان امنیت محصولات غذایی | Generally Regarded As Safe | GRAS |
| ایمنو گلوبین Y | Immunoglobulin Y | IgY |
| ایمنوگلوبین E | Immunoglobulin E | IgE |
| ایمنوگلوبین G | Immunoglobulin G | IgG |
| میواینوزیتول هگزاکیس فسفات | myo-Inositol Hexakisphosphate | Ins P6 |
| اینوزیتول پلی فسفاتها | Inositol Poly Phosphates | IPPs |
| تیوگالاکتوپیرانوزید ایزوپروپیل | Isopropyl β -D-thiogalactopyranoside | IPTG |
| اتحادیه بین الملل شیمی خالص و کاربردی- اتحادیه بین المللی بیوشیمی | International Union of Pure and Applide Chemistry- International Union of Biochemistry | IUPAC-
IUB |
| کیلوباز | Kilobase (pair) | kb |
| کیلودالتون | kiloDalton | kDa |
| لوریا- برتانی | Lauria – Bertani | LB |
| بانک جهانی اطلاعات بیوتکنولوژی | National Center of Biotechnology Information | NCBI |
| چگالی نوری | Optic Density | OD |
| چارچوب خواندن آزاد | Open Reading Frame | ORF |
| واکنش زنجیره‌ای پلیمراز | Polymerase Chain Reaction | PCR |
| پروتئین تیروزین فسفات | Protein Tyrosine Phosphatase | PTP |
| پلی اتیلن گلایکول | Polyethylene glycol | PEG3 |
| جایگاه اتصال ریبوزوم | Ribosomal Binding Site | RBS |
| دور در دقیقه | Round per minute | rpm |
| سدیم دودسیل سولفات –
ژل الکتروفورز پلیاکریل آمید |
Sodium Dodecyl Sulfate –
Polyacryl Amide Gel Electrophoresis |
SDS-PAGE |
مقدمه
1-1 اهمیت موضوع
به آنچه که کامل کننده رژیم غذایی مورد نیاز افراد است، “مکمل” گفته می شود. انرژی مکمل‌ها بر اساس نوع آن ها متفاوت است. به طور کلی مکمل‌های غذایی شامل مواد غذایی یعنی کربوهیدرات‌ها، پروتئینها، چربی‌ها، املاح، مواد معدنی و ویتامین‌ها هستند. از طرفی برخی مواد غذایی هستند که به طور طبیعی دارای اثراتی اثبات شده بر سلامتی می باشند اما مشاهده شده است که برخی مواد غذایی و یا نوشیدنی‌ها دارای اثراتی بر سلامتی هستند که این اثرات را نمی توان به محتوای مواد مغذی (نظیر درشت مغذی‌ها، ویتامین‌ها و یا مواد معدنی) آن ماده ی غذایی نسبت داد این مواد غذائی غذاهای عمل گرا نامیده می شوند. امروزه مصرف کنندگان در بسیاری از موارد ترجیح می دهند اقلام مورد نیاز خود را از بین غذاهای عمل گرا انتخاب کنند. غذاهای عمل گرا محصولاتی مشتق از مواد غذایی می باشند که علاوه بر ارزش تغذیه ای آن ها، موجب ارتقای شرایط طبیعی فیزیولوژیک یا عملکرد ذهنی شده و یا در پیشگیری از اختلالاتی که می توانند به بیماری منجر شوند، موثر هستند (worldfood. ir).
هلیکو باکتر پیلوری شایع‌ترین موجود ذره‌بینی است که انسان‌ها را در بعد جهانی مبتلا به عفونت ساخته است و بیش از نیمی از مردم دنیا آلوده به این باکتری هستند (انجمن میکروب شناسی آمریکا، 2013). این باکتری نوعی باکتری گرم منفی مارپیچی شکل و یک پاتوژن گوارشی انسان است و مهمترین علت بیماری‌های معده ای-روده ای از جمله گاستریک مزمن، زخم معده و دوازدهه، سرطان معده و لنفوما است (کاور و بلاسر،1995). بررسی‌های اپیدمیولوژی و آماری عفونت مزمن H. پیلوری را با سرطان بدخیم معده مرتبط دانسته اند و این امر موجب شده كه آژانس پژوهش سرطان سازمان بهداشت جهانی (World Health Organization: WHO)این باكتری را در زمره ی عوامل سرطان زای کلاس I قرار دهد (سوارز و همکاران،2006). میزان عفونت H. پیلوری در جهان بطور میانگین 50% است اما بین شیوع این عفونت در كشورهای غربی و كشورهای آسیایی در حال توسعه تفاوت معنی داری وجود دارد (مالاتی و نیرن،2007). به طوری كه این میزان در كشورهای غربی حدودا 30% جمعیت است که از این میان بین 1/0-1 درصد به سرطان معده مبتلا می شوند در حالی که میزان عفونت در کشور‌های آسیائی بالاتر و در حدود 80-60 درصد است (سوربن و میچتی،2002). عفونت هلیکو باکتر پیلوری در ایران نیز شایع بوده و به خصوص سرطان معده از آمار بالائی بر خوردار است. این سرطان كه مسئول مرگ 650000 نفر در جهان در سال 2000 است، در مردها پس از سرطان ریه دومین عامل مرگ و میر ناشی از سرطان بوده و در مجموع حدود 10 درصد از كل مرگ و میر سالیانه سرطان را به خود اختصاص می دهد (پرینز و همکاران،2010). میزان عفونت H. پیلوری در جمعیت اردبیل بالا و در حدود 89 درصد بوده است و یكی از بالاترین آمارهای جهان در رابطه با سرطان معده مربوط به استان اردبیل است كه به تنهایی حدود یک سوم تمام موارد سرطان در اردبیل بین سال‌های 1996 تا 1999 مربوط به این سرطان بوده است (سجادی و همکاران،2003) (البرزی و همکاران،2006). به علاوه بررسی‌ها در شهر شیراز نیز ابتلای 98-82 درصد كودكان بین 9 ماهه تا 10 ساله را به این باكتری نشان می دهد (البرزی و همکاران،2006) (ندیمی و همکاران،2000). فاکتور بیماری زای cagA هلیکو باکتر پیلوری یک پروتئین با وزن مولکولی 120-145KD می باشد که در فاصله ی Kb 40 جزایر بیماری زائی[1] کد شده است. گونه‌های هلیکو باکتر پیلوری از نظر دارا بودن ژن CagA به گونه‌های مثبت[2] و منفی[3] تقسیم میشوند که تقریبا 60 درصد گونه‌های جدا شده از کشور‌های غربی و اکثریت گونه‌های جدا شده از شرق آسیا از نوع مثبت بودند (هاتاکیاما و هیگاشی،2005). عفونت هلیکو باکتر پیلوری با لنفومای MALT و سرطان معده در ارتباط است و تصور می شود که CagA در گسترش سرطان نقش داشته باشد (لکس،2005). ژن CagA فسفریله شده قادر به برقراری ارتباط با تیروزین فسفاتاز SHP-2 است که باعث عملکرد فعال و تغئیر ظاهری سلول میزبان به یک فنوتیپ متحرک تر می شود که به عنوان فنوتیپ مرغ مگس خوار شناخته شده است (هاتاکیاما و هیگاشی، 2005). این فنوتیپ شبیه به اثر تولید شده توسط فاکتور رشد کبدی بوده که ممکن است در جنبه‌های مختلف سرطان از جمله متاستاز دخالت داشته باشد (لکس،2005). همچنین CagA یک پروتئین دارای خاصیت آنتی ژنیکی بسیار قوی است که با واکنش‌های برجسته ی التهابی تولید شده به وسیله ی استخراج اینترلوکین-8 در ارتباط است (یامائوکا،2010). تشخیص سرطان معده در مراحل اولیه دشوار است و در اكثر موارد تشخیص پس از پیشرفت بیماری صورت گرفته و کار درمان سخت می شود در نتیجه مانند التهاب و زخم معده راه اصلی مبارزه با این سرطان نابود کردن عفونت H. پیلوری است از طرفی به دلیل اینکه سیستم ایمنی بدن در مقابل H. پیلوری دارای مکانیسم دفاعی است و حتی طی مكانیز م‌های ویژ ه ای در خدمت بیمار یزایی باكتری قرار می گیرد و سبب تسهیل اتصال باكتری وتخریب بافت پوششی می شود مبارزه با این عفونت همواره با مشکلاتی همراه است. (سوارز و همکاران،2006). بعلاوه بررسی‌های اخیرنشان دهنده ی مقاومت نسبتا زیاد H. پیلوری به درمان‌های آنتی بیوتیکی است (موبلی و همکاران،1995). در نتیجه درمان‌های اخیر در جهت به کارگیری درمان‌های اختصاصی و نوین برای مقابله با این عفونت است که در این میان پروتئین CagA که یکی از پروتئینهای H. پیلوری است هدف بالقوه مناسبی برای تولید آنتی بادی‌های اختصاصی به این منظور است. از سوی دیگر امروزه، در عرصة كاربرهای متنوع آنتی بادی‌ها، تكنولوژی جدید استخراج IgYاز زرده ی تخم مرغ در حال گسترش است. IgY که معادل IgG انسانی در پرندگان در نظر گرفته می شود در واقع از نظر تکاملی،نیای مادری IgG و IgE پستانداران است. این ایمنوگلوبین توسط مرغ تولید شده و برای ایجاد ایمنی غیر فعال برای جنین به درون زرده تخم مرغ انتقال می یابد. تکنولوژی IgY از این پدیده از طریق استخراج IgY از زرده ی تخم مرغ بهره می برد (بصیری و همکاران،2008). برای تولید یک واکسن موثر بر علیه هلیکو باکتر پیلوری، آنتی ژنی پایدار،حفاظت شده و قوی مورد نیاز است. امروزه تکنولوژی استفاده از آنتی ژنهای نوترکیب پروتئینی برای ایمن سازی به سمت شناسائی اپی توپ‌های اصلی آنتی ژن برای تحریک ایمنی و استفاده از آنها بجای پروتئین کامل پیش می رود. مطالعات نشان داده که پروتئینهای نوترکیب در اکثر موارد خواص ساختاری پروتئین طبیعی را دارد. تولید پروتئین در حالت طبیعی بسیار اندک است اما میتوانیم در حالت نوترکیب به میزان دلخواه آن را افزایش دهیم بعلاوه خالص سازی پروتئینهای نوترکیب نسبت به پروتئینهای طبیعی راحت تر صورت میگیرد و در مورد باکتری‌های با رشد نسبتا کم و پر نیاز مثل هلیکوباکتر پیلوری تولید پروتئینهای نوترکیب در مقایسه با پروتئینهای طبیعی بسیار مقرون به صرفه است. در صورت استفاده از اپی توپ‌های اصلی آنتی ژن بجای آنتی ژن کامل علاوه بر کوچک شدن قطعه مورد بررسی و بالا رفتن اختصاصیت قطعه که باعث تحریک شدن پاسخ‌های ایمنی اختصاصی تر می شود تکثیر و ترکیب آن با سایر آنتی ژنها راحت تر صورت میگیرد (ابطحی و همکاران،2012). مطالعات نشان داده که در زرده ی تخم مرغ حاصل از مرغ‌های ایمن شده مقادیر زیادی آنتی بادی وجود دارد که میتوانند آنتی ژنها را بطور اختصاصی شناسائی کنند و از نظر اقتصادی بسیار مقرون به صرفه هستند (وردولاوا و همکاران،2000). بعلاوه شاین و همکاران تاثیر Igy ضد H. پیلوری بدست آمده از مرغ‌های ایمن شده را گزارش کردند که در این مطالعه Igy موجب کاهش التهاب لایه مخاطی معده گردید. بعلاوه میزان التهاب با تعیین میزان لنفوسیت‌های بافتی و نفوذ نوتروفیل‌ها مشخص شد (شاین و همکاران،2003). بنابراین میتوان از آنتی بادی اختصاصی تولید شده در زرده ی تخم مرغ برای درمان بیماران مبتلا به عفونت H. پیلوری استفاده کرد.
تعداد صفحه :117
قیمت :14700 تومان
بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد
و در ضمن فایل خریداری شده به ایمیل شما ارسال می شود.
پشتیبانی سایت : * parsavahedi.t@gmail.com
در صورتی که مشکلی با پرداخت آنلاین دارید می توانید مبلغ مورد نظر برای هر فایل را کارت به کارت کرده و فایل درخواستی و اطلاعات واریز را به ایمیل ما ارسال کنید تا فایل را از طریق ایمیل دریافت کنید.
14,700 تومانافزودن به سبد خرید