دانشگاه ایلام
دانشکده کشاورزی
پایان نامه کارشناسی ارشد در رشته بیماری شناسی گیاهی
بررسی تنوع ژنتیکی جدایه های
Fusarium oxysporum f. sp. ciceri
عامل بیماری پژمردگی نخود در استان ایلام
استاد راهنما:
دکتر خشنود نوراللهی
استاد مشاور:
مهندس حسن یونسی
شهریور 93
(در فایل دانلودی نام نویسنده موجود است)
تکه هایی از متن پایان نامه به عنوان نمونه :
(ممکن است هنگام انتقال از فایل اصلی به داخل سایت بعضی متون به هم بریزد یا بعضی نمادها و اشکال درج نشود ولی در فایل دانلودی همه چیز مرتب و کامل است)
چکیده
نخود مهمترین گیاه از خانواده حبوبات در حوزه مدیترانه، شبه قاره هند، غرب آسیا و شمال آفریقا است. بیماری پژمردگی نخود با عامل Fusarium oxysporum f. sp. ciceri یکی از مهمترین بیماریهای این گیاه در جهان بهشمار میرود. این بیماری در تمام مناطق نخودکاری ایران گزارش شده است. بیماری همه ساله در تمام مناطق نخودکاری استان ایلام باعث خسارت فراوانی می شود بطوریکه در برخی از مزارع به 50 % تا 70 % هم میرسد. این تحقیق به منظور بررسی و تعیین تنوع ژنتیکی قارچ عامل بیماری زردی و پژمردگی نخود انجام گرفت. برای این منظور از مناطق نخودکاری استان شامل شش شهرستان از جمله آسمانآباد، ایوان، بدره، چرداول، درهشهر، سرابله نمونهبرداری صورت گرفت. پس از جداسازی، خالصسازی و شناسایی قارچ عامل بیماری و معرفی F. oxysporum f. sp. ciceri به عنوان عامل غالب بیماری، بررسی تنوع ژنتیکی جدایهها با بهره گرفتن از پنج جفت نشانگر ریزماهواره صورت گرفت، نهایتاً در مجموع 17 آلل در بین جمعیتها مشاهده شد نتایج تجزیه واریانس مولکولی حاکی از تنوع بالای درون جمعیتی معادل 92 درصد و تنوع پایین بین جمعیتهای مناطق مختلف در حدود 8 درصد داشت. جریان ژنی (Nm) بالا و برابر 589/7 بهدست آمد. بنابراین تمایز ژنتیکی (Gst) به میزان کمی 0618/0 مشاهده گردید. دندروگرام رسم شده بر اساس فاصله ژنتیکی بین جمعیتهای مورد مطالعه در این تحقیق، نشان داد که جمعیتهای آسمانآباد و سرابله در دو گروه جدا قرار گرفته اند و نسبت به جمعیت-های دیگر تفاوت ژنتیکی بیشتری دارند. نتایج حاصل از این تحقیق در جهت کمک به متخصصین اصلاح نباتات و بیماریشناسان گیاهی در جهت اصلاح ارقام نخود میباشد.
کلیدواژه: نخود، Fusarium oxysporum f. sp. ciceri، تنوع ژنتیکی، ریزماهواره
| فهرست مطالب
|
|
| عنوان | صفحه |
| چکیده……………………………………………………………………………………………………….. | د |
| فهرست مطالب…………………………………………………………………………………………….. | ه |
| فهرست جدولها ………………………………………………………………………………………….. | ی |
| فهرست شکلها……………………………………………………………………………………………. | ل |
| فصل اول
|
|
| 1-1-مقدمه…………………………………………………………………………………………………. | 2 |
| فصل دوم | |
| 2-1- آشنایی با سیمای استان ایلام……………………………………………………….…………… | 5 |
| 2-1-1- آب و هوای استان ایلام……………………………………………………..…….………… | 5 |
| 2-2- جایگاه تاریخی نخود………………………………………………………………………..…… | 6 |
| 2-3- اهمیت و جایگاه نخود در جهان و ایران…………………………………..………………… | 6 |
| 2-4- گیاهشناسی نخود…………………………………………………………..……………………… | 7 |
| 2-4-1- انواع نخود……………………………………………………..……..………………………… | 7 |
| 2-4-2- ارزش غذایی دانه نخود……………………………………………………………………… | 8 |
| 2-5- موقعیت زراعی نخود در استان ایلام……………………………………………………..…… | 8 |
| 2-6- بیماریهای نخود……………………………………………………………………….…….…… | 8 |
| 2-6-1- بیماری پژمردگی فوزاریومی نخود………………………………………………..……… | 9 |
| 2-6-2- جنس فوزاریوم ………………………………………………………………………………… | 10 |
| 2-6-2-1- طبقه بندی فوزاریوم………………………………………..……………………………… | 10 |
| 2-6-2-2- نامگذاری و طبقه بندی…………………………………………….……………………… | 11 |
| 2-6-2-3- مرحله زادآوری جنسی…………………………………………………………………… | 11 |
| 2-6-2-4- مرحله غیرجنسی…………………………………………………………………………… | 11 |
| 2-6-3- همهگیری بیماری……………………………………………………………………………… | 12 |
| 2-6-3-1- علائم بیماری……………………………………………………………………………….. | 12 |
| 2-6-3-2- چرخه بیماری………………………………………….…………………………………… | 13 |
| 2-6-3-3- شرایط محیطی……………………………………………………………………………… | 14 |
| 2-6-3-4- گسترش بیماری………………………………………….………………………………… | 14 |
| 2-7- روشهای کنترل بیماری پوسیدگی ریشه نخود…………………………………………… | 15 |
| 2-7-1- روش زراعی……………………………………………………….…………………………… | 15 |
| 2-7-2- روش شیمیایی………………………………………………..………………………………… | 15 |
| 2-7-3- مبارزه بیولوژیکی……………………………………………………………………………… | 15 |
| 2-7-4- ارقام مقاوم……………….……………………………………………………………………… | 15 |
| 2-8- تنوع بیماریزایی و تنوع ژنتیکی .Fusarium ssp………………………………………… | 16 |
| 2-8-1- بررسی تنوع ژنتیکی F. oxysporum با بهره گرفتن از نشانگرهای ……………..SSR | 17 |
| فصل سوم
|
|
| 3-1- نمونهبرداری………………………………………………………………………………………… | 24 |
| 3-2- جداسازی قارچ عامل بیماری از بافتهای گیاهی آلوده………………………………… | 32 |
| 3-3- محیط کشتهای مورد استفاده………………………………………………………………… | 32 |
| 3-3-1- محیط کشتهای جداسازی………………………………………………………………… | 32 |
| 3-3-1-1- محیط کشت سیبزمینی- دکستروز- آگار………………………………………… | 32 |
| 3-3-1-2- محیط کشت پپتون- پنتاکلرونیتروبنزن- آگار……………………………………… | 33 |
| 3-3-2- محیط کشتهای خالصسازی………………………………………..…………………… | 34 |
| 3-3-2-1- محیط کشت آب- آگار……………………………….………………………………… | 34 |
| 3-3-3- محیط کشتهای شناسایی…………………………………………………………………… | 34 |
| 3-3-3-1- محیط کشت برگ میخک- آگار…………………………………..………………… | 34 |
| 3-3-3-2- محیط کشت مواد غذایی خاص…………………..…………………………………… | 35 |
| 3-4- شناسایی قارچ عامل بیماری…………………………..………………………………………… | 35 |
| 3-5- تهیه کشت خالص و نگهداری جدایهها……………………………………………………… | 36 |
| 3-5-1- روش تک اسپور کردن ……………………………………………………………………… | 36 |
| 3-5-2- روش نوکهیف……………………………………………………….……………………… | 36 |
| 3-5-3- نگهداری کشت خالص قارچ……………………….……………………………………… | 37 |
| 3-6- محلولهای رنگی مورد استفاده برای رنگآمیزی و مشاهده قارچ………………… | 37 |
| 3-6-1- محلول اریتروزین……………………………………………………………………………… | 37 |
| 3-6-2- محلول آبی پنبه در آب……………………………………………………………………… | 37 |
| 3-7- بررسی آزمون بیماریزایی در گلخانه………………..……………………………………… | 38 |
| 3-8- آزمایشهای مولکولی……………………………………………….…..……………………… | 38 |
| 3-8-1- استخراج DNA ……………………………………………………………………….……… | 38 |
| 3-8-1-1- مراحل استخراج DNA …………………………………………..……………………… | 39 |
| 3-8-2- بررسی کیفیت استخراج……………………………………………………………………… | 40 |
| 3-9- بررسی تنوع ژنتیکی جدایه با کمک نشانگرهای SSR……………………………..…… | 41 |
| 3-10- تجزیه و تحلیل داده ها ………………………………………………….……………………… | 43 |
| فصل چهارم
|
|
| 4-1- نتایج جداسازی جدایهها………………………………………….……………………………… | 45 |
| 4-1-1- مشخصات قارچ در محیط کشت PDA…………………….…………………………… | 45 |
| 4-2- آزمون بیماریزایی………………..……………………………………………………………… | 46 |
| 4-3- نتایج تجزیه و تحلیل داده های مولکولی……………………………………………..……… | 47 |
| 4-3-1- توزیع فراوانی آللها در جمعیتها و جایگاههای ریزماهواره……………….……… | 47 |
| -3-2- ویژگی آغازگرهای استفاده شده برای جدایهها………………….……………………… | 48 |
| 4-3-3- آزمون مانتل………………………………………..…………………………………………… | 51 |
| 4-3-4- گروهبندی جدایههای F. oxysporum……………………..…………………………… | 52 |
| 4-3-5- تجزیه به مختصات اصلی در جدایههای F. oxysporum مورد مطالعه………..… | 55 |
| 4-4- تنوع ژنتیکی جمعیتها……………………………………………………..…………………… | 57 |
| 4-4-1- اطلاعات تنوع ژنتیکی پنج جایگاه SSR برای جمعیتها……………….…………… | 57 |
| 4-4-2- درصد چندشکلی در جمعیتهای مورد مطالعه………………………………………… | 58 |
| 4-4-3- بررسی فاصله ژنتیکی و شباهت ژنتیکی در جمعیتها………………………..……… | 58 |
| 4-4-5- بررسی میزان جریان ژنی در جمعیتها…………………………………………………… | 60 |
| 4-4-6- تجزیه به مختصات اصلی و رسم بایپلات بر اساس نشانگر SSR………………… | 60 |
| 4-4-7- تجزیه واریانس مولکولی………………………………………………….………………… | 61 |
| 4-5- بحث…………………………………………………………………………….…………………… | 62 |
| 4-5-1- نتیجه گیری کلی……………………………..…..……………………….…………………… | 65 |
| 4-7- پیشنهادات……………………………………………………………..….………………………… | 66 |
| فهرست منابع……………………………………………………………………………………..………… | 67 |
|
فهرست جدولها
|
|
| عنوان و شماره | صفحه |
| جدول 3-1- مشخصات جدایههای بدست آمده از مناطق مختلف…………………………… | 25 |
| جدول 3-2- اجزای محیط کشت پپتون-پنتاکلرونیتروبنزن- آگار……………………….…… | 33 |
| جدول 3-3- مواد تشکیل دهنده محیط کشت مواد غذایی خاص…………………….……… | 35 |
| جدول 3-4- ترکیبات بافر استخراج DNA………………………………………………………… | 39 |
| جدول 3-5- مشخصات آغازگرهای ریزماهواره مورد استفاده………………………………… | 42 |
| جدول 4-1- توزیع فراوانی آللها در جمعیتها…………………………………………..……… | 48 |
| جدول 4-2- ویژگیهای آغازگرهای استفاده شده…………………………………………….… | 48 |
| جدول 4-3- شاخص نشانگری، نسبت چندگانه مؤثر و میزان چندشکلی (PIC) ………… | 49 |
| جدول 4-4- اطلاعات مربوط به آللهای موجود………………………………………….……… | 50 |
| جدول 4-5- ضمیمه (شکل4-8) ………………………………………………..…………………… | 55 |
| جدول 4-6- تخمین تنوع ژنتیکی در جمعیتها…………………………………………………… | 57 |
| جدول 4-7- درصد چندشکلی در جایگاههای ژنی……………………………………………… | 57 |
| جدول 4-8- اندازه، مشخصات و فاصله ژنتیکی بین زوج جمعیتها………………………… | 59 |
| جدول 4-9- میزان جریان ژنی (Nm) و تمایز ژنتیکی GST در جمعیتها………………… | 60 |
| جدول4-10- خصوصیات مؤلفه های حاصل از تجزیه به مختصات اصلی……………..…… | 61 |
| جدول 4-11- تجزیه واریانس مولکولی (AMOVA) داده ها……………….………………… | 62
|
| فهرست شکلها
|
|
| عنوان و شماره | صفحه |
| شکل 2-1- چرخه بیماری زردی و پژمردگی نخود……………………………………………… | 13 |
| شکل 3-1- موقعیت جغرافیایی مناطق نمونهبرداری شده……………..………………………… | 24 |
| شکل 3-2- نمونه های آلوده به بیماری زردی و پژمردگی…………………………………… | 25 |
| شکل 3-3- بررسی کیفیت DNA ژنومی…………………………………………………………… | 41 |
| شکل 4-1- پرگنه قارچ F. oxysporum f. sp. ciceri در محیط کشت PDA……..…… | 45 |
| شکل 4-2- تصاویر میکروسکوپی قارچ F. oxysporum f. sp. ciceri…………….……… | 46 |
| شکل 4-3- آزمون بیماریزایی…………………………..…………………………………………… | 47 |
| شکل 4-4- باندهای DNA حاصل از تکثیر آغازگرهای SSR1……………………………… | 50 |
| شکل 4-5- باندهای DNA حاصل از تکثیر آغازگرهای SSR2……………………………… | 51 |
| شکل 4-6- باندهای DNA حاصل از تکثیر آغازگرهای SSR9……………………………… | 51 |
| شکل 4-7- آزمون مانتل………………………………………………………………………………… | 52 |
| شکل 4-8- دندروگرام ارتباط ژنتیکی به روش UPGMA …………………………………… | 53 |
| شکل 4-9- دندروگرام ارتباط ژنتیکی به روش الحاق مجاور………………………….……… | 54 |
| شکل4-10- نمودار دوبعدی تجزیه به مؤلفه اصلی…………………..…………………………… | 56 |
| شکل 4-11- نمودار سه بعدی تجزیه به مؤلفه های اصلی…………………………..…………… | 56 |
| شکل 4-12- دندروگرام ارتباط ژنتیکی ایجاد شده بوسیله UPGMA ………..…………… | 59 |
| شکل 4-13- نمودار دوبعدی پراکنش جمعیتها……………………………………….………… | 60 |
| شکل 4-14- نمودار مربوط به تجزیه واریانس مولکولی جمعیتها…………….…………… | 62 |
مقدمه
نخود زراعی (Cicer arietinum L.) گیاهی خودگشن، دیپلوئید (2n=2x=16)، یکساله با ژنوم کوچک738mbp) ~) میباشد [27]. نخود مهمترین گیاه از خانواده حبوبات در حوزه مدیترانه، شبه قاره هند ، غرب آسیا و شمال آفریقا است [57]. اصلیترین كشورهای تولیدكننده نخود در جهان به ترتیب هند، پاكستان، تركیه، ایران و استرالیا هستند [48].
نخود، منبع بسیار مناسبی برای روی، آهن و پروتئین است. همچنین به لحاظ میزان فیبرهای رژیمی، بسیار غنی بوده و میزان چربی اندكی دارد که از نوع اسیدهای چرب غیراشباع میباشد، انواع نخود به طور متوسط دارای 19 درصد پروتئین، 13 درصد چربی و 68 درصد كربوهیدرات میباشند، همچنین به لحاظ تأمین میزان كلسیم مورد نیاز نیز حائز اهمیت است [96]. سطح زیر كشت نخود در ایران 640 هزار هكتار و تولید سالیانة آن در حدود 400 هزار تن است [85، 59، 29]. طبق آمارهای انتشار یافته از سوی سازمان خوار و بار جهانی میزان تولید جهانی این محصول در سال 2010 میلادی 10 میلیون تن بوده که سهم ایران از آن حدود 233686 تن بوده است [45].
قارچ Fusarium oxysporum یک پاتوژن خاکزاد با دامنه میزبانی وسیع بوده كه باعث پژمردگی آوندی در گیاهان مختلف می شود [26]. بیماری پژمردگی فوزاریومی نخود با عاملF. oxysporum f. sp. ciceri مهمترین بیماری خاكزاد این گیاه در جهان خصوصًا در شبه قاره هند، حوزه مدیترانه و كالیفرنیا بشمار میرود، كاهش عملكرد سالیانه نخود در اثر این بیماری از ١٠ تا ١٥ درصد متغیر است ولی بیماری می تواند در شرایط خاص كل محصول را از بین ببرد [68]. این بیماری در ایران نیز از اغلب مناطق نخودكاری گزارش شده و میزان خسارت آن در برخی نقاط کشور تا ٢٢ درصد هم برآورد شده است [18]. بیماری زردی و پژمردگی نخود یكی از مهمترین بیماریهای نخود در استان ایلام میباشد که در این استان همه ساله در تمام مناطق نخودکاری باعث خسارت فراوانی می شود، بطوریکه در برخی از مزارع به 50 %تا 70 % هم میرسد [21]. از آنجاییکه نخود ارزش غذایی بسیار بالایی دارد و یكی از ارزانترین منابع تامین پروتئین گیاهی (بین 12 تا 31 درصد پروتئین) میباشد و بیماری پژمردگی یکی از تهدیدهای جدی برای این محصول محسوب می شود، از طرفی مبارزه با این بیماری همانند سایر بیماریهای خاكزاد مشكل است و کنترل این بیماری با بهره گرفتن از مواد شیمیایی مقرون به صرفه نخواهد بود، بنابراین طبق بررسی بیماریشناسان گیاهی بهترین روش کنترلی این بیماری استفاده از بذر سالم و ارقام مقاوم میباشد. یکی از راه های رسیدن به ارقام مقاوم پایدار، شناخت قارچ عامل بیماری و بررسی تنوع ژنتیکی آن در مناطق کشت محصول مورد نظر است تا معرفی ارقام مقاوم با اطمینان بالایی صورت گیرد، تغییرات ژنتیکی در قارچهای بیمارگر از جنبه تهیه ارقام مقاوم حائز اهمیت است، ردیابی این تغییرات با روشهای سنتی مستلزم صرف هزینه زیاد و از دست رفتن زمان خواهد بود. استفاده از روشهای مولکولی در تعیین تنوع ژنتیکی بین جمیت بیمارگر موجب کسب اطلاعات مربوط به وقوع نوترکیبی ژنتیکی آنها می شود [66]. یکی از روشهای مولکولی که برای تعیین تنوع ژنتیکی جمعیتهای بیمارگر به کار میرود نشانگرهای ریزماهواره هستند، نشانگرهای ریزماهواره ابزار قوی به منظور طبقه بندی و مطالعه ژنتیک جمعیتها را فراهم می کنند [42، 35]. این نشانگرها جایگاههای ترکیبشده از توالیهای ساده تکراری هستند که به صورت تصادفی در سراسر ژنوم قارچها و دیگر یوکاریوتها پخش شده است [97، 86، 64]. این توالیها عموما از چندشکلی بالایی برخوردارند [47].
این بیماری در استان ایلام خسارت زیادی وارد می کند، و یکی از بیماریهای بسیار مهم نخود در این استان به حساب میآید. یکی از روشهای کنترلی این بیماری، مبارزه شیمیایی میباشد اما از آنجاییکه مبارزه شیمیایی روشی بسیار خطرناک برای محیط زیست و انسان تلقی می شود، بهترین روش کنترل این بیماری استفاده از بذر سالم و ارقام مقاوم میباشد. به همین دلیل بررسی تنوع ژنتیکی جدایههای عامل بیماری با بهره گرفتن از نشانگرهای ژنتیکی این بیماری در این استان انجام میگیرد. هدف این پژوهش آن است که با تجزیه و تحلیل تنوع ژنتیکی، برنامهای یکپارچه برای مقاومت در برابر این بیماری اعمال شود.
هدف از تحقیق حاضر عبات از :
جداسازی و شناسایی قارچ عامل بیماری زردی و پژمردگی نخود و بررسی تنوع ژنتیکی قارچ عامل بیماری
تعداد صفحه : 103
قیمت :14700 تومان
بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد
و در ضمن فایل خریداری شده به ایمیل شما ارسال می شود.
پشتیبانی سایت : * parsavahedi.t@gmail.com
در صورتی که مشکلی با پرداخت آنلاین دارید می توانید مبلغ مورد نظر برای هر فایل را کارت به کارت کرده و فایل درخواستی و اطلاعات واریز را به ایمیل ما ارسال کنید تا فایل را از طریق ایمیل دریافت کنید.
14,700 تومانافزودن به سبد خرید