دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی ساری
دانشکده علوم زراعی
گروه زراعت و اصلاح نباتات
پایان نامه دوره کارشناسی ارشد در رشته مهندسی کشاورزی گرایش بیوتکنولوژی
موضوع:
مطالعه ژنتیکی و نقشه یابی ژن رنگ پایه ساقه با بهره گرفتن از نشانگرهای مولکولی ریزماهواره (SSR) در برنج
اساتید راهنما:
دکتر غلامعلی رنجبر
دکتر قربانعلی نعمت زاده
استاد مشاور:
دکتر غفار کیانی
(در فایل دانلودی نام نویسنده موجود است)
تکه هایی از متن پایان نامه به عنوان نمونه :
(ممکن است هنگام انتقال از فایل اصلی به داخل سایت بعضی متون به هم بریزد یا بعضی نمادها و اشکال درج نشود ولی در فایل دانلودی همه چیز مرتب و کامل است)
فهرست مطالب:
فصل اول: مقدمه
1-1- تولیدکنندگان برنج………………………………………………………. 2
1-2- کشت برنج در ایران…………………………………………………….. 2
1-3- متابولیتهای ثانویه درگیاهان…………………………………………… 3
1-4- تهیه نقشه های ژنتیک………………………………………………… 4
فصل دوم: کلیات و مرورمنابع
2-1- مشخصات گیاهشناسی برنج……………………………………….. 7
2-2- وضعیت ژنتیکی برنج…………………………………………………… 7
2-3- مهندسی تولید متابولیتهای ثانویه درگیاهان………………………. 8
2-4- ژنهای مسئول بیوسنتز فلاوونوئیدها و آنتوسیانینها……………….. 9
2-5- برنج رنگی……………………………………………………………… 11
2-6- نشانگرها در برنامه های اصلاحی………………………………….. 12
2-6-1- تعریف نشانگر………………………………………………………. 12
2-6-2- انواع نشانگرها…………………………………………………….. 13
2-6-2-1- نشانگرهای موفولوژیکی…………………………………………13
2-6-2-2- نشانگرهای سیتوژنتیکی………………………………………. 13
2-6-2-3- نشانگرهای بیوشیمیایی……………………………………… 14
2-6-2-4- نشانگرهای مولکولی…………………………………………… 14
2-6-2-4-1- نشانگرهای مولکولی مبتنی بر DNA……………………….
2-6-2-4-1-1- نشانگرهای مولکولی مبتنی بر هیبریداسیون…………… 15
2-6-2-4-1-2- نشانگرهای مولکولی مبتنی بر واکنش زنجیرهای پلیمراز..16
2-6-2-4-1-3- نشانگرهای مولکولی مبتنی بر PCR و هیبریداسیون….. 16
2-6-2-4-1-4- نشانگرهای مبتنی بر توالییابی (SNPها) و تراشه DNA….
2-7- کاربرد نشانگرهای مولکولی………………………………………. 17
2-8- انتخاب میان انواع مختلف نشانگرها…………………………….. 19
2-9- کاربرد نشانگرهای مولکولی در برنج……………………………… 19
2-10- انتخاب به کمک نشانگرها……………………………………….. 21
2-11- استفاده از نشانگرهای مولکولی درتهیه نقشه ژنتیکی……… 21
2- 12- ریزماهواره…………………………………………………………. 22
2-12-1- تشخیص آللهای ریزماهواره……………………………………. 24
2-12-2- مزایای نشانگرهای ریزماهواره………………………………… 24
2-12-3- مشکلات کار با ریزماهواره…………………………………….. 25
2-12-3-1- اشتباهات آلل خوانی……………………………………….. 25
2-12-3-2- آللهای صفر……………………………………………………. 26
2-12-3-3- اندازه نمونه مورد نیاز………………………………………… 26
2-12-4- ریزماهوارهها درگیاهان و برنج………………………………….. 27
2-12-5- کاربردهای ریزماهواره…………………………………………… 28
2-13- نقشه های پیوستگی ژنتیکی…………………………………… 28
2-14- ویژگیهای نقشه…………………………………………………….. 29
2-15- سابقه نقشه یابی صفت رنگ دربرنج…………………………… 30
2-15-1- ارتباط بین رنگ پریکارپ وصفت گلوتیوز ………………………..33
2-15-2- توارث رنگ نوک دانه و ارتباط آن با صفات دیگر……………….. 33
2-15-3- روابط بین رنگ کلاله با صفات دیگر…………………………….. 34
2-15-4- ارتباطات بین رنگ پوشبرگ و صفات دیگر…………………….. 34
2-15-5- ارتباط بین رنگ کلاله و رنگ پوشبرگ…………………………. 35
2-15-6- ارتباط بین رنگ زبانک با صفات دیگر………………………….. 35
2-15-7- ارتباطات بین رنگ زبانک و رنگ پریکارپ……………………… 35
2-15-8- نشاندار کردن ژنهای مهم اقتصادی و انتخاب به کمک نشانگر (همراه)…36
2-15-9- مطالعه ژنتیکی و نشاندارکردن ژن صفت رنگ در برنج……… 37
فصل سوم: مواد و روشها
3-1- مواد گیاهی…………………………………………………………. 41
3-1-1- رقم 18-33DN-……………………………………………………
3-1- 2- رقم ندا ……………………………………………………………42
3-2- کشت والدین و جمعیت F2…………………………………………
3-3- تهیه نمونه برگی…………………………………………………… 43
3-4- ارزیابی صفت……………………………………………………….. 44
3-5- استخراج DNA ………………………………………………………
3-5-1- روش استخراج DNA……………………………………………..
3-6- بررسی کمیت و کیفیت DNA استخراج شده…………………… 49
3-6-1- ازطریق اسپکتروفتومتر…………………………………………. 49
3-6-2- به وسیله الکتروفورز ژل آگارز…………………………………… 49
3-7- بارگذاری نمونه ها و اجرای الکتروفورز…………………………… 50
3-8- آماده سازی آغازگرهای ریزماهواره……………………………… 51
3-9- انجام واکنش PCR………………………………………………….
3-10- تجزیه وتحلیل داده ها…………………………………………….. 54
فصل چهارم: نتایج و بحث
4-1- ارزیابی فنوتیپی…………………………………………………… 57
4-2- ارزیابی مولکولی…………………………………………………… 58
4-2-1- غربال والدین……………………………………………………… 58
4-2-2- تحلیل لینکاژ ………………………………………………………60
4-3- ارزیابی نشانگر RM253 در ارقام دیگر برنج……………………… 64
فصل پنجم
پیشنهادات……………………………………………………………….. 68
منابع………………………………………………………………………..70
ضمائم
لیست پرایمرهای بکار رفته در پژوهش………………………………… 79
تهیه محلولهای مادری…………………………………………………… 81
ماتریس داده های مولکولی و فنوتیپی…………………………………. 83
چکیده:
وجود رنگدانه های آنتوسیانین در برنج عامل اصلی تولید پایه ساقه ارغوانی رنگ محـسوب می شود. رنگ پایه ساقه در برنج رابطه مستقیم و قوی با تشکیل دانه های رنگی در برنج دارد که در زیر پوسته آنها به دلیل تراکم متفاوت رنگیزههای آنتوسیانین در لایه های مختلف پریکارپ، پوشش دانه و آلورون، رنگهای سرخ، ارغوانی و سیاه مشاهده می شود. به منظور درک درست از مسیر بیوسنتزی آنتوسیانین که اطلاعات مفیدی را در زمینه بیولوژی مولکولی و ژنتیک برنج به همراه خواهد داشت، الگوی تفرق ژن رنگ پایه ساقه با بهره گرفتن از تعداد 123 تک بوته از جمعیتF2 حاصل از تلاقی 18-33 – DN و ندا مورد مطالعه قرار گرفت. ارزیابی تک بوته های F2 بر اساس رنگ پایه ساقه نشان داد تعداد 83 بوته رنگی (ارغوانی) و تعداد 40 بوته بیرنگ تولید شده نسبت تفرق 1 :075/2 را ایجاد مینماید. آماره c2 این نسبت تفرق برابر 48/3 بود که از نسبت تفکیک 3:1 اختلاف معنی داری را نشان نداد (95/0p < ). در نتیجه ثابت شد که صفت مورد نظر از سیستم کنترل تک ژنی تبعیت مینماید. مطالعات انجام شده با بهره گرفتن از 59 نشانگر مولکولی میکروساتلیت میزان 28 درصد چند شکلی بین والدین را نشان داد و آنالیز پیوستگی روی تک بوته های مغلوب جمعیت F2 از تلاقی ندا × 18-33 – DNثابت کرد که ژن رنگ پایه ساقه بر روی بازوی کوتاه کروموزوم شماره 6 برنج با نشانگرRM253 که در فاصله 15 سانتی مورگان از ژن قرار دارد همبسته می باشد.
فصل اول: مقدمه
1-1- تولیدکنندگان برنج
برنج پس از گندم دومین غله مهم در دنیا به حسـاب می آید و به عنوان یکی از مهمترین محصولات استراتژیک جهان از اهمیت و جایگاه ویژهای برخوردار است، نزدیک به 90 درصد سطح زیر کشت و تولید برنج متعلق به کشورهای خاور دور میباشد. بیش از نصف محصول برنج دنیا در دو کشور هند و چین تولید می شود. به طور کلی، کشورهای گرمسیری و نیمه گرمسیری برمه، تایلند، ویتنام، لائوس، اندونزی، فیلیپین، پاکستان، هند، آمریکا، ژاپن، ایتالیا، مصر، چین، برزیل، کوبا، مکزیک و استرالیا از تولیدکنندگان عمده برنج به شمار میآیند. میزان تولید برنج در تایلند، برمه، ویتنام و لائوس بیش از مصرف داخلی آنهاست و بنابراین نزدیک به 90 درصد برنج موجود در بازارهای دنیا متعلق به این 4 کشور میباشد (53).
2-1- کشت برنج در ایران
کشت برنج در ایران در نواحی شمالی و در نواحی جنوبی به ویژه خوزستان تاریخچه طولانی دارد. شواهد نشان میدهد که این محصول در این ناحیه، قرنها پیش از میلاد مسیح و در زمان هخامنشیان رواج داشته است. در ایران اسلامی نیز علی رغم دستاوردهای خوب تحقیقاتی و قریب به 600 هکتار زیر کشت برنج، متاسفانه به دلیل استفاده ناصحیح و توسعه محدود ارقام اصلاح شده و با توجه به رشد روز افزون جمعیت ایران، تولید داخلی برنج پاسخگوی نیاز مردم نیست و مقادیر قابل توجهی از خارج وارد می شود. افزایش تولید به دو روش افزیش سطح زیر کشـت و افزایش در واحد سطـح امـکانپذیر میباشد. بدلیل محدود بودن زمینهای زراعی و نیز کمبود شدید آب، بدون تردید باید تولید را در واحد سطح با بهره گرفتن از روشهای بهزراعی و بهنژادی افزایش داد. دستیابی به خودکفایی در تولید برنج و حفظ ثبات قیمت آن، از جمله اهداف مهم در کشورهای کم درآمدی است که برنج بعنوان تنها غذای اصلی، اساس تأمین نیازهای غذایی بوده و برای مردم فقیر و آسیب پذیر این کشورها شغل و درآمد ایجاد می نماید(53).
3-1- متابولیت های ثانویه در گیاهان
بعضی از موجودات زنده خصوصاً گیاهان، طیف وسیعی از ترکیبات موسوم به متابولیتهای ثانویه را تولید می کند. در مفهوم کلی، متابولیتهای ثانویه ترکیبات آلی هستند که نقش ضروری در رشد و نمو موجود زنده ندارند. با مطالعاتی که تا کنون صورت گرفته است، به نظر میرسد که متابولیتهای ثانویه به عنوان مواد طبیعی نقش اکولوژیکی مهمی در واکنشهای دفاعی گیاهان و همچنین گرده افشانی و انتشار دانه های گیاهان به وسیله حشرات و حیوانات دارند. بعضی از این ترکیبات به عنوان علفکش و حشره کش در صنعت استفاده میشوند در حالی که برخی دیگر کاربرد صنعتی ندارند. دسته بزرگی از متابولیت های ثانویه کاربرد دارویی و پزشکی دارند. ترکیبات دیگری از این گروه نیز نقش مهمی در تغذیه انسان و دام و كیفیت مواد غذایی (رنگ، طعم و بو) مختلف دارند (72).
به دلیل كاربردهای فراوان، متابولیتهای ثانویه موضوع جالبی برای تحقیقات اصلاح نباتات از طریق روشهای مولكولی و مهندسی ژنتیـك محسـوب میشوند. مطالعه در زمینه وظایف این تركیبات در گیاهان، یک موضوع جالب و مهم برای بسیاری از پروژه های تحقیقاتی شده است و نقش تعدادی از این تركیبات مورد بررسی و تحقیق قرار گرفته است.
در ده سال گذشته تحقیقات چندانی در ارتباط با متابولیتهای ثانویه انجام نشده است. مانع بزرگ در انجام این تحقیقات اطلاعات اندك از مسیرهای تولید زیستی متابولیتهای ثانویه و برهم كنش آنزیم های درگیر در این مسیر همچنین اطلاعات محدودی از ژنهای مربوط به متابولیتهای ثانویه در دسترس است. یكی از مسیرهایی كه مطالعات بیشتری در سطح ژنهای دست اندركار آن نسبت به دیگر متابولیتهای ثانویه انجام شده است، مسیـر تولید فلاوونوئیدها و آنتوسیـانینها است (20). اكثـر ژنهای درگیر در مسیر تولید آنتوسیانینها همسانهسازی شده و مطالعات فراوانی در سطح بیوشیمیایی، مولكولی و ژنتیک این دست از متابولیتهای ثانویه صورت گرفته است. یكی از مهمترین دلایل مطالعات بیشتر در این زمینه، آسانی بررسی این مواد از روی رنگ گلها، نوک دانه و پایه ساقه در گیاهانی همچون برنج است که بر اساس فنوتیپ قابل ارزیابی است (73). هدف از مهندسی ژنتیک مسیر یک متابولیت ثانویه، افزایش مقدار یک ماده خاص یا گروهی از تركیبات و یا حتی كاهش مقدار این تركیبات است. برای دستیابی به هدف دوم كه كاهش میزان تولید یک ماده خاص یا گروهی از مواد ناخواسته است، راههای مختلفی وجود دارد. این مواد ممكن است تركیبات سمی در یک محصول گیاهی، مواد مانع خالص سازی یک فرآورده صنعتی یا موادی از این دست باشد. یكی از این راهها، مسدود كردن یک مرحله از مسیر تولید متابولیت ثانویه و مختل كردن تولید یا فعالیت آنزیم مربوط به آن مرحله است. این هدف می تواند با كاهش میزان mRNA مسئول تولید این آنزیم، با بهره گرفتن از فناوری آنتیسنس، RNAi یا بیان بالای یک آنتیبادی علیه آنزیم مسئول محقق شود. فناوری آنتیسنس برای تغییر رنگ به طور گستردهای استفاده شده است. راههای دیگر دستیابی به این هدف، تغییر مسیر به سوی مسیرهای موازی یا افزایش كاتابولیسم محصول نهایی است. اما ممكن است هدف از انجام تحقیقات، افزایش تولید یک تركیب خاص در گیاه بوده یا انتقال ژنهای مربوط به مسیر تولید یک متابولیت ثانویه به یک گیاه یا یک ریزسازواره مورد نظر باشد. همچنین ممكن است تولید یک ماده جدید كه به صورت طبیعی در گیاهان تولید نشود هدف یک پروژه تولیدی- پژوهشی باشد. در بـرخی روشها با تغییر میزان بیان یک یا چند ژن، بر موانع تولید یک ماده غلبه می كنند و در روش های دیگر، با حذف مسیرهای موازی (رقابتی) یا كاهش كاتابولیسم ماده مورد نظر، مقدار آن ماده را در گیاه میافزایند. ایجاد تغییراتی در بیان ژنهای تنظیمی كه كنترل مسیر تولید زیستی متابولیتهای ثانویه را برعهده دارند نیز از جمله روشهای افزایش یا كاهش تولید تركیب مورد نظر است.
4-1- تهیه نقشه های ژنتیک
ریشه بسیاری از محدودیتهای روشهای مختلف اصلاح نباتات، نبود زیر بنا و مقدمات ضروری اساسی برای مطالعات ژنتیک است. یکی از اجزای کلیدی و زیر بنایی و ابزار اساسی مورد نیاز برنامه-های آینده اصلاح نباتات، تهیه نقشههای ژنتیک است. شاید یکی از مهمترین کاربرد نشانگرهای DNA تهیه نقشه-های ژنتیک باشد که براساس آن میتوان جایگاه ژنی و کروموزومی ژنهای تعیین کننده صفات مطلوب (ترتیب و فاصله ژنها و نشانگرها از یکدیگر بر روی کروموزوم ها) را تعیین کرد.
با دانستن جایگاه یک ژن روی نقشه ژنتیک، میتوان از نشانگرهای مجاور آن برای احراز جود یک صفت متناظر استفاده کرد. بدین ترتیب نیازی به انتظار برای ظهور آثار ژن نیست. با بهره گرفتن از نشانگرهای DNA می توان صفات و مشخصات آینده یک نشای برنج را پیش بینی کرد. در نتیجه تاثیری مثبتی بر اصلاح و پیشبرد گیاه دارد.
هدف از این پژوهش، مطالعه ژن کنترل کننده رنگ پایه ساقه در ژنوم برنج و شناسایی جایگاه ژنومی آن از طریق مارکرهای همبسته و ارزیابی نشانگرهای مولکولی ریزماهواره در شناسایی ارقام دارای ژن کنترل کننده رنگ پایه ساقه میباشد. این مطالعه پیش نیاز مطالعات مولکولی بوده و مواد اصلاحی با ارزشی را برای آنها از طریق شناسایی نشانگرهای مولکولی همبسته با ژن فراهم میآورد.
فصل دوم: کلیات و مرور منابع
1-2- مشخصات گیاهشناسی برنج
برنج یکی از گیاهان تیره غلات و متعلق به Poaceae (Gramineae) و قبیله Oryzae است، دارای جنسها و گونه های زیادی است که مهمترین آن جنس Oryza sativa است.
ساقه برنج[1] راست، استوانهای و جز در قسمتی که گرهها وجود دارد توخالی است. ارتفاع ساقه از 60 تا 200 سانتیمتر متفاوت میباشد. برنج علاوه بر ساقه اصلی، 4 تا 5 ساقه فرعی دارد. برگهای برنج بصورت متناوب در دو توالی در دو طرف ساقه قرار گرفتهاند. برگ برنج دارای غلاف، پهنک، زبانک و گوشوارک است. همچنین برنج مانند گندم، دارای گلآذین خوشهای میباشد که دانهها در آن قرار می گیرند. سنبلهها به طور انفرادی و با فاصله کم روی پانیکل قرار گرفتهاند. هر سنبلچه شامل یک عدد گلچه بارور است و هر گلچه دارای دو گلوم کوتاه میباشد. برخلاف سنبلچههای گندم، جو و ذرت که فشرده و نزدیک بهم هستند، سنبلچههای برنج بصورت غیرفشرده روی محورهای اصلی و فرعی گلآذیـن قرار می گیرد. خوشه برنج دارای گلهای دوجنسی انفردی است که در خوشچههای تک گلی قرار دارند (4).
جنس اوریزا که بعنوان گیاه زراعی مورد کشت و کار قرار میگیرد دیپلوئید (2n=24) بوده و دارای شش پرچم است. برنج زراعی دارای سه زیر گونه به نام هندی (ایندیکا)، ژاپنی (ژاپونیکا) و جاوهای (جاوانیکا) میباشد که هر یک دارای ویژگیهای مورفولوژی خاصی هستند.
[1] – Culm
تعداد صفحه : 100
قیمت :14700 تومان
بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد
و در ضمن فایل خریداری شده به ایمیل شما ارسال می شود.
پشتیبانی سایت : serderehi@gmail.com
در صورتی که مشکلی با پرداخت آنلاین دارید می توانید مبلغ مورد نظر برای هر فایل را کارت به کارت کرده و فایل درخواستی و اطلاعات واریز را به ایمیل ما ارسال کنید تا فایل را از طریق ایمیل دریافت کنید.
14,700 تومانافزودن به سبد خرید
