دانشکده تولید گیاهی
پایان‌نامه جهت اخذ درجه کارشناسی‌ارشد در رشته
مهندسی کشاورزی (علوم باغبانی) – میوهکاری
عنوان:
بررسی شاخصهای پیری و ردیابی ژن آلفامانوزیداز مرتبط با پیری در چند رقم گیلاس
استاد راهنما:
دکتر مهدی شریفانی
اساتید مشاور:
دكتر فریال وارسته اکبرپور
دکتر سعید نوابپور
(در فایل دانلودی نام نویسنده موجود است)
تکه هایی از متن پایان نامه به عنوان نمونه :
(ممکن است هنگام انتقال از فایل اصلی به داخل سایت بعضی متون به هم بریزد یا بعضی نمادها و اشکال درج نشود ولی در فایل دانلودی همه چیز مرتب و کامل است)
فهرست مطالب:
1- مقدمه و كلیات…………………………………………………………………………………………………………………. 2
1-1- مقدمه……………………………………………………………………………………………………………………. 2
1-2- اهداف…………………………………………………………………………………………………………………… 3
1-3- فرضیه ها………………………………………………………………………………………………………………… 4
2- سابقه تحقیق…………………………………………………………………………………………………………………….. 6
2-1- خاستگاه و گیاهشناسی گیلاس………………………………………………………………………………… 6
2-2- طبقه بندی ارقام گیلاس……………………………………………………………………………………………. 7
2-3- کیفیت میوه……………………………………………………………………………………………………………. 7
2-3-1- آنتوسیانین……………………………………………………………………………………………………. 7
2-3-2- اسیدیته………………………………………………………………………………………………………… 8
2-3-3- مواد جامد محلول…………………………………………………………………………………………. 8
2-3-4- سفتی بافت…………………………………………………………………………………………………… 9
2-3-5- کلروفیل و کاروتنوئید…………………………………………………………………………………….. 9
2-3-6- کربوهیدراتها……………………………………………………………………………………………. 10
2-4- بلوغ و رسیدگی در گیلاس……………………………………………………………………………………. 10
2-5- انبارمانی گیلاس…………………………………………………………………………………………………… 11
2-6- فیزیولوژی تنفس…………………………………………………………………………………………………… 12
2-7- اسید آبسیزیک……………………………………………………………………………………………………… 13
2-8- پیری……………………………………………………………………………………………………………………. 14
2-9- کنترل ژنتیکی متابولیسم گیاه…………………………………………………………………………………. 14
2-10- آنزیم آلفامانوزیداز و نقش آن در رسیدگی……………………………………………………………. 15
3- مواد و روش کار……………………………………………………………………………………………………….. 18
3-1- زمان و مکان آزمایش……………………………………………………………………………………………. 18
3-2- بخش بیوشیمیایی…………………………………………………………………………………………………. 18
3-2-1- مواد گیاهی………………………………………………………………………………………………… 18
3-2-2- طرح آماری آزمایش……………………………………………………………………………………. 18
3-2-3- اندازه گیری سفتی……………………………………………………………………………………….. 19
3-2-5- اندازه گیری آنتوسیانین………………………………………………………………………………… 19
3-2-6- اندازه گیری کلروفیل دم میوه……………………………………………………………………….. 19
3-2-7- اندازه گیری مواد جامد محلول میوه……………………………………………………………… 21
3-2-8- اندازه گیری اسیدیته قابل تیتراسیون میوه………………………………………………………. 21
3-2-9- اندازه گیری قند…………………………………………………………………………………………… 21
3-2-9-1- مواد مورد نیاز………………………………………………………………………………….. 21
3-2-9-2- استخراج قند…………………………………………………………………………………….. 22
3-2-9-3- اندازه گیری قند کل……………………………………………………………………………. 22
3-2-9-4- منحنی استاندارد قند کل……………………………………………………………………. 23
3-2-9-5- اندازه گیری فروکتوز………………………………………………………………………….. 23
3-2-9-6- تهیه نمودار استاندارد فروکتوز……………………………………………………………. 24
3-3- بخش بیوتکنولوژی……………………………………………………………………………………………….. 25
3-3-1- مواد گیاهی………………………………………………………………………………………………… 25
3-3-2- استخراج DNA…………………………………………………………………………………………. 25
3-3-3- طراحی آغازگرها………………………………………………………………………………………… 26
3-3-4- تکثیر قطعات انتخابی………………………………………………………………………………….. 27
3-3-5- ارزیابی محصول PCR به وسیله تکنیک الکتروفورز ژل آگارز………………………… 28
3-3-6- توالییابی محصول PCR…………………………………………………………………………….. 28
3-4- تجزیه و تحلیل آماری……………………………………………………………………………………………. 28
4- نتایج و بحث………………………………………………………………………………………………………… 30
4-1- تاثیر کاربرد پس از برداشت اسید آبسیزیک بر سفتی میوه گیلاس…………………………….. 30
4-2- تاثیر کاربرد پس از برداشت اسید آبسیزیک بر تغییرات آنتوسیانین میوه گیلاس………… 33
4-3- تاثیر کاربرد پس از برداشت اسید آبسیزیک بر کلروفیل کل و کاروتنوئید دم میوه گیلاس 36
4-4- تاثیر کاربرد پس از برداشت اسید آبسیزیک بر میزان مواد جامد محلول میوه گیلاس…. 42
4-5- تاثیر کاربرد پس از برداشت اسید آبسیزیک بر میزان اسیدیته قابل تیتراسیون میوه گیلاس 45
4-6- تاثیر کاربرد پس از برداشت اسید آبسیزیک بر میزان قند کل و فروکتوز میوه گیلاس…. 48
4-7- استخراج DNA…………………………………………………………………………………………………… 53
4-8- نتایج حاصل از طراحی آغازگر………………………………………………………………………………. 54
4-9- تکثیر ژن آلفامانوزیداز در پنج رقم گیلاس……………………………………………………………… 54
4-10- بررسی نتایج حاصل از توالییابی و همردیفسازی توالیهای بدست آمده……………….. 56
4-11- روابط فیلوژنی توالیهای مورد بررسی…………………………………………………………………. 60
4-12- نتیجه گیری کلی………………………………………………………………………………………………….. 61
4-13- پیشنهادات…………………………………………………………………………………………………………. 62
فهرست منابع……………………………………………………………………………………………………………….. 64
چکیده:
این کار تحقیقی در دو بخش بیوشیمیایی و بیوتکنولوژی در محل آزمایشگاه علوم باغبانی دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان انجام شد. در بخش بیوشیمیایی، جهت بررسی تاثیر کاربرد پس از برداشت اسید آبسیزیک بر شاخصهای کیفی و روند پیری دو رقم زودرس و دیررس گیلاس، آزمایشی فاکتوریل در قالب طرح بلوکهای کامل تصادفی و در چهار تکرار صورت گرفت. تیمار اول، رقم (کرج و تکدانه) و تیمار دوم، اسید آبسیزیک (در دو غلظت صفر و ppm200) مورد بررسی قرار گرفتند. میوهها در فواصل زمانی پنج روز و طی مدت 20 روز از زمان برداشت، از لحاظ تغییرات صفات کیفی ارزیابی شدند. طبق نتایج بدست آمده، با گذشت زمان، سفتی در هر دو رقم کاهش یافته، و در نمونههای تیمار شده با اسید آبسیزیک کاهش بیشتری نشان داد. میزان آنتوسیانین روند افزایشی داشت. میزان کلروفیل کل و کاروتنوئید دم میوهها با گذشت زمان به طور معنیداری کاهش یافت. مواد جامد محلول میوهها تا روز دهم کاهش و در روز پانزدهم افزایش پیدا کرد. اسیدیته میوهها روند نزولی داشت و در روز بیستم اختلاف معنیداری بین نمونههای تیمار شده و تیمار نشده مشاهده شد. با گذشت زمان در میزان قند کل میوهها تغییر معنیداری مشاهده نشد اما به طور کلی تغییرات قند کل دارای روند افزایشی بود. روند تغییرات فروکتوز برای نمونههای تیمار شده و تیمار نشده با اسید آبسیزیک، در رقم کرج معنیدار نبود اما بین رقم تکدانه تیمار شده و تیمار نشده با اسید آبسیزیک اختلاف معنیداری در روز 15 و 20 مشاهده گردید. با توجه به این نتایج، میتوان نقش اسید آبسیزیک را در ایجاد تغییرات کیفی و همچنین تاثیر بر روند پیری میوهها، مورد توجه قرار داد. در بخش بیوتکنولوژی، ژن آلفامانوزیداز (یک ژن مرتبط با پیری) برای اولین بار، در پنج رقم مختلف گیلاس شناسایی و تعیین توالی شد. به این منظور، آغازگرهای رفت و برگشت ژن مورد نظر از طریق مراجعه به پایگاه داده NCBI و استفاده از توالیهای مربوط به ژن آلفامانوزیداز برای هلو و فلفل، با بهره گرفتن از کپی کامل cDNA هلو و فلفل طراحی شد. به علت زیاد بودن طول ژن سه جفت آغازگر طراحی شد گه این آغازگرها قادرند طول 3100 جفتباز را پوشش دهند. همچنین دمای اتصال آغازگرها با بهره گرفتن از برنامه گرادیانت PCR بدست آمد. بعد از استخراج DNA ارقام گیلاس، یک قسمت از ژن مذکور تکثیر، توالییابی (با بهره گرفتن از نرمافزار سنگر) و همردیفسازی توالیها انجام شد و نمودار دندروگرام مربوط به آن با بهره گرفتن از نرمافزار 3 View رسم گردید. بررسی و مقایسه توالیهای معکوس، شباهت و تفاوتهایی را در ارقام مختلف نشان داد که بر طبق آن ارقام پیشرس (ER)، پیشرس خارجی (FE) و دیررس (LR) دارای شباهت بیشتر بوده و در یک گروه قرار گرفتند. ارقام پیشرس قزوین (GH) و دومرس (MR) دارای تفاوت بیشتری نسبت به سه رقم اول بوده و با یکدیگر نیز تفاوت نشان داده و هرکدام به طور جداگانه یک گروه مجزا را تشکیل دادند.این تفاوتها میتوانند در عملکرد ژن و در نتیجه رفتار گیاه تاثیرگذار باشند. به عنوان مثال، با مطالعات بیشتر و استفاده از تکنیکهای مهندسی ژنتیک، میتوان علت زمانهای متفاوت رسیدگی و تفاوت در طول عمر انبارمانی موجود در ارقام مختلف گیلاس را در این اختلاف توالیها جستجو نمود.
فصل اول: مقدمه و کلیات
1- مقدمه و کلیات
1-1- مقدمه
از دیرباز پدیده عمر یکی از مسائل مهم حیات بوده است. از اینرو افزایش عمر برای موجودات گیاهی، جانوری و یا انسان می تواند حائز اهمیت باشد.
پیری در گیاهان به عنوان مرحلهی نهایی نمو تعریف شده است. از مشخصههای بارز پیری کنترل روند تغییرات بسیار منظم و کنترل شده فعل و انفعالات فیزیولوژیکی است. از جمله مهمترین این رخدادها توقف فتوسنتز، تجزیه کلروپلاست، کاهش چشمگیر کلروفیل و شکستن پروتئینها و لیپیدها و سایر مولکولهای بزرگ میباشد (نواب پور و همکاران، 2003).
در میوههای فرازگرا اتیلن عامل اصلی پیر شدن میوه میباشد و کنترل اتیلن از مکانیسمهای اصلی جلوگیری از پیری در این میوهها است. اما گیلاس یک میوهی نافرازگرا است. این میوه دارای ارقام متفاوتی از نظر طول عمر میباشد که شناسایی عوامل دخیل در تعیین طول عمر در ارقام زودرس و دیررس می تواند منجر به افزایش طول عمر گیلاس گردد.
طی رسیدن میوه، دستهای از فرآیندهای بیوشیمیایی که از لحاظ ژنتیکی در گیاه برنامه ریزی شده اند رخ میدهد که باعث تغییر ویژگیهای میوهی نارس و تبدیل آن به میوهی رسیده می‌شود (برامل، 2006). همچنین بعد از برداشت محصولات، تغییرات مختلف ساختاری ادامه مییابند که در جهت تخریب بافت میوه عمل می کنند (یو و همکاران، 2003). نرم شدن بیش از حد میوهها مسالهای است که عمر پس از برداشت آنها را کاهش میدهد. در محصولات تراریخته با تغییر در بیان ژن پروتئینها و آنزیمهایی که بر ویژگیهای دیوارهی سلولی تاثیرگذار هستند، میتوان میزان فعالیت و تاثیر آنزیمهایی مثل پلی گالاکتوروناز را در روند رسیدگی و نرم شدن محصول بررسی کرد (برامل و هارپستر، 2001 و واکابایاشی، 2000).
نرم شدن و تغییرات بافتی طی رسیدن میوهها در هر گونهی خاص، ویژگیهای مخصوص به خود را داراست (برامل و همکاران، 2004). علاوه بر این، تحقیقات نشان داده است که آنزیمهای آلفامانوزیداز (α-Man) و بتادی ان استیل هگزوسامینیداز (ß -Hex) در رسیدگی و نرم شدن میوههای نافرازگرا نقش دارند (قوش و همکاران، 2010).
با توجه به نافرازگرا بودن میوهی گیلاس، مشخص نیست که بین ارقام زودرس و دیررس این میوه چه بخشی از ژنهای α-Man و ß-Hex و ژن توسعهی سلولی (EXP) باعث تفاوت در طول عمر انباری گیلاسهای زودرس و دیررس میگردد. همچنین مشخص نمیباشد که شاخصهای پیری بین دو رقم زودرس و دیررس چه تفاوتی از نظر فعالیتهای آنزیمی α-Man و ß -Hex، لیپاز، پروتئاز و همچنین مقادیر قند، مواد جامد محلول، نشاسته، ساکارز سینتئاز و اینورتاز در طی دوران رسیدگی و پیری دارند. تفاوت الگوی ژنی این آنزیمها در سطح ژنومیک نیز مشخص نیست.
در این پژوهش، توالی یک ژن نامزد عامل پیر شدن به نام آلفامانوزیداز از پایگاه اطلاعاتی ژنوم هلو و فلفل استخراج گشت. بر اساس توالی به دست آمده و کاربرد نرم افزار پرایمر3، توالی پرایمرهای اختصاصی مناسب برای تکثیر این ژن نامزد، طراحی و سپس ساخته شد و ژن مربوطه از DNA ژنومیک گیلاس استخراج و به کمک دستگاه ترموسایکلر و روش زنجیرهای پلیمراز تکثیر و سپس به کمک دستگاه توالییاب تعیین توالی شد. در مرحلهی بعد با کاربرد نرمافزار پاپ ژن، توالی بهدست آمده برای ژن استخراج شده و ارقام زودرس و دیررس مورد مقایسه قرار گرفت و اختلافات موجود از نظر حذف تک نقطهای و یا قطعهای و یا اضافه شدن ارزیابی شد. در این تحقیق اثر اسید آبسیزیک نیز بر شاخصهای پیری مورد بررسی قرار گرفت.
2-1- اهداف
1- تشخیص تفاوتهای توالی ژن مذکور (α-Man) بین دو رقم زودرس و دیررس و تشخیص هرگونه تفاوت در توالی هر تک نوکلئوتید یا موتاسیون تک نقطهای و مقایسه این ژنها بین ارقام گیلاس زودرس با انبارداری پایین و دیررس با انبارداری بالا
2- مقایسه شاخصهای پیری بین این دو رقم گیلاس زودرس و دیررس
3- تعیین تغییرات گلوکز، فروکتوز در زمان رسیدگی و پیری و طیف تغییرات آنها در میوه گیلاس
3-1- فرضیه ها
1- ارقام گیلاسی که دیررس و دارای طول عمر انبارداری زیادتر هستند، دارای تفاوت در توالی ژن مربوطه میباشند که این احتمالا مربوط به منطقه دومین آنزیم میباشد.
2- کاربرد هورمون اسید آبسیزیک در ارقام دیررس باعث بروز پیری با تاخیر بیشتری نسبت به ارقام زودرس میگردد.
تعداد صفحه : 88
قیمت :14700 تومان
