پایان نامه بررسی تنوع ژنتیکی و احتمال وقوع نوترکیبی در جدایه ­های ویروس موزاییک هندوانه با بهره گرفتن از نرم‌افزارهای بیوانفورماتیک

دانشکده علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان

دانشکده­ تولید گیاهی

پایان ­نامه جهت اخذ درجه کارشناسی‌ارشد در رشته

بیماری شناسی گیاهی

عنوان:

بررسی تنوع ژنتیکی و احتمال وقوع نوترکیبی در جدایه ­های ویروس موزاییک هندوانه با بهره گرفتن از نرم‌افزارهای بیوانفورماتیک

استاد راهنما:

دکتر سعید نصراله­نژاد

اساتید مشاور:

مهندس فروه سادات مصطفوی نیشابوری

مهندس میثم تقی نسب درزی

(در فایل دانلودی نام نویسنده موجود است)

تکه هایی از متن پایان نامه به عنوان نمونه :

(ممکن است هنگام انتقال از فایل اصلی به داخل سایت بعضی متون به هم بریزد یا بعضی نمادها و اشکال درج نشود ولی در فایل دانلودی همه چیز مرتب و کامل است)

فهرست مطالب:

فصل اول: مقدمه

1-1- گیاهشناسی محصولات جالیزی…………………………………………………………………………………….. 2

1-2- اهمیت محصولات جالیزی…………………………………………………………………………………….. 3

1-3- سطح زیر کشت……………………………………………………………………………………………… 4

1-4- بیماری‌های ویروسی جالیز…………………………………………………………………………………….. 4

فصل دوم: بررسی منابع

2-1- ویژگی­های گروه پوتی­ویروس………………………………………………………………………………………. 8

2-2- ویروس موزاییک هندوانه……………………………………………………………………………………………… 9

2-2-1- دامنه­ میزبان………………………………………………………………………………………………………… 10

2-2-2- اپیدمولوژی ویروس……………………………………………………………………………………………….. 11

2-2-3- نشانه­ های بیماری ویروس موزاییک هندوانه………………………………………………………………… 12

2-3- تمایز سرولوژیکی جدایه­های ویروس…………………………………………………………………………….. 13

2-4- نوترکیبی و تنوع ژنتیکی ویروس­های گیاهی…………………………………………………………………… 14

2-5- تنوع ژنتیکی ویروس موزائیک هندوانه. 16

2-6- بررسی­های صورت گرفته در مورد ویروس موزاییک هندوانه در دنیا……………………………………. 17

2-6-1- ویروس موزاییک هندوانه درایران………………………………………………………………………………. 17

2-6-2- ویروس موزاییک هندوانه در خارج از کشور………………………………………………………………. 22

فصل سوم: مواد و روش­ها

3-1- زمان و مکان تحقیق……………………………………………………………………………………………………. 34

3-2- جمع آوری نمونه­ها و داد­ه………………………………………………………………………………………….. 34

3-3- آزمون الایزا………………………………………………………………………………………………………………. 35

3-3-1- آزمون الیزای غیر مستقیم…………………………………………………………………………………………… 35

3-4- آزمون PCR………………………………………………………………………………………

3-4-1- استخراج RNA و ساخت cDNA……………………………………………………………………………………….

3-4-2- مرحله PCR………………………………………………………………………………………

3-4-2-1- آغازگرهای اختصاصی………………………………………………………………………………………. 38

3-5- روش تهیه­ ژل و انجام الکتروفورز برای بررسی نتایج آزمون PCR……………………………………

3-6- ترادف‌یابی محصول PCR………………………………………………………………………………………

3-7- تجزیه و تحلیل داده­ ها…………………………………………………………………………………….. 40

فصل چهارم: نتایج

4-1- نتایج آزمون الایزا…………………………………………………………………………………….. 42

4-2- نتایج آزمون RT-PCR………………………………………………………………………………………

4-3- تنوع ژنتیکی بین جدایه ­های WMV…………………………………………………………………………

4-4- نوترکیبی بین جدایه­ هایWMV………………………………………………………………………………..

4-5- مقایسه شباهت­ها و تفاوت­های ناحیه CP جدایه­های WMV در سطح نوکلئوتیدی و آمینواسیدی….52

6- موتیف­های موجود در جدایه WMV ………………………………………………………………………………..

 فصل پنجم: بحث

بحث………………………………………………………………………………………………………………………………… 57

پیشنهادات اجرایی و پژوهشی…………………………………………………………………………………………………. 62

منابع………………………………………………………………………………………………………………………………… 63

چکیده:

ویروس موزاییک هندوانه (WMV) یکی از ویروس­های مهم جالیز است که گسترش جهانی دارد و از بسیاری از مناطق دنیا گزارش شده است. به دلیل اهمیت کشت جالیز در استان گلستان و آلودگی گسترده ویروس در این گیاهان شناخت دقیق وضعیت ویروس در منطقه مهم می­باشد. یه منظور شناسایی این ویروس، 100 نمونه از گیاهان هندوانه، خربزه، کدو و خیار با علایم مشکوک به بیماری از مزارع استان گلستان جمع‌ آوری و با آنتی سرم اختصاصی WMV در آزمون الایزای غیر مستقیم مورد بررسی قرار گرفت. از گیاهان آلوده، RNA ویروس با بهره گرفتن از کیت (Roche) mRNA capture استخراج و cDNA تهیه گردید. جهت تکثیر ناحیه پروتئین پوششی ویروس از آغازگرهای اختصاصی در واکنش RT-PCR استفاده گردید. محصول PCR به طور مستقیم ترادف یابی شد و ترادف به دست آمده شامل 964 نوکلئوتید همراه با 31 ترادف انتخاب شده از GenBank مقایسه شدند. همردیف­سازی­های چندگانه و آنالیزهای فیلوژنتیک و تعیین نسبت جانشینی نامترادف (dN) به جانشینی مترادف (dS) با نرم‌افزارهای DNASTAR، DNAMAN، Clustal X وMEGA5  انجام و درخت فیلوژنتیک به روش neighbor-joining ترسیم گردید. برای آنالیز نوترکیبی بین جدایه­ها از نرم افزار RDP3 با بهره گرفتن از متد BootScan استفاده شد. در این بررسی تعداد 18 نمونه در واکنش الایزای مثبت و بقیه منفی بودند. نتایج بدست آمده از درخت فیلوژنتیکی این جدایه­ها را در 4 گروه قرار داد که همه جدایه­های استان گلستان در یک گروه و در کنار جدایه­هایی از اصفهان، شیروان، مشهد، کرمان، یزد و تعدای از کشورهای اروپایی قرار گرفتند و بیشترین شباهت را به جدایه­ای از اصفهان داشت و در میان سایر کشورها به جدایه ترکیه (6/96%) در سطح نوکلئوتیدی شبیه تر بود و در سطح آمینواسیدی بیشترین درصد تشابه را با جدایه اسپانیا (3/97%) داشت. محاسبه تنوع ژنتیکی (π) نشان داد که برای تمامی گروه­ ها این میزان 061/0 می باشد. نسبت dN/dS در گروه­ های فیلوژنتیک کمتر از 1 بدست آمد که نشان دهنده نقش موثر انتخاب منفی در تنوع و تکامل این ویروس می­باشد. همچنین نتایج نشان داد که در میان جدایه­های ایرانی تنها یک مورد نوترکیبی وجود دارد که مربوط به جدایه یزد بوده که در ناحیه ابتدای ژن پرتئین پوششی خود ترکیبی از ترادف نوکلئوتیدی جدایه اصفهان را دارا می­باشد. اما در بین جدایه­های سایر کشورها اکثر موارد نوترکیبی در ناحیه CP ژنوم ویروس مشاهده می­ شود. با این وجود می­­توان با انجام آنالیزهای اجدادی بررسی کرد که جد اصلی این ویروس مربوط به کدام منطقه جغرافیایی است و به ترادف نوکلئوتیدی کدام کشور نزدیکتر است.

فصل اول: مقدمه

1-1- گیاهشناسی محصولات جالیزی (کدو، خیار، خربزه، هندوانه)

به طورکلی سیستم ریشه‌ای گیاهان صیفی زراعی، گسترده اما کم عمق است و بیشتر ریشه­ها در یک متری فوقانی خاک قرار دارد. ساقه اصلی از محور گیاهچه رشد می­ کند و ممکن است شاخه‌های جانبی کم یا زیاد (8 یا بیشتر) داشته باشد که از گره‌های نزدیک قاعده ساقه بیرون می­آیند. در هیچ یک از گیاهان صیفی عوامل خود ناسازگاری شناخته شده وجود ندارد (امیر اصلانی، 1384).

تیره كدوئیان شامل 100 جنس و حدود 1000 گونه است. برگ­های این گیاهان، ساده، متناوب، دارای دمبرگ دراز و پهنك كامل یا لوب­دار و در هرحال فاقد استیپول است. گل­های آنها منظم، یكپایه، مركب از قطعات 5 تایی، منفرد یا مجتمع به صورت گرزن است (بیتس و همکاران، 1990). نباتات خانواده کدوئیان تمام خزنده و ساکن نواحی گرم و بنابراین حساس به سرما می‌باشند. هرچند که قسمت مورد استفاده گیاهان خانواده کدوئیان میوه آن می‌باشد معهذا این گیاهان را جزو سبزی­ها قرار داده‌اند (شیبانی، 1364).

در جنس Cucumis دو نوع گیاه قرار می­گیرد یکی انواع خربزه و طالبی (C.melo) و دیگری خیار (C.sativus). در جنس Cucumis مانند سایر افراد خانواده کدوئیان بوته‌ها بیشتر یک پایه هستند ولی گاهی گیاه دوپایه و ندرتاً گل دوجنسی در بوته‌های خربزه و خیار دیده می‌شود. از نظر گیاهشناسی بوته خربزه و خیار بسیار شبیه به یکدیگر می‌باشند یعنی در هر دو گیاه برگ­ها گرد قلبی شکل بوده و دارای رنگ سبز روشن می‌باشد ولی رشد بوته خربزه خیلی زیادتر از رشد بوته خیار است، گل­های نر و ماده از هم جدا و در بغل برگ­ها قرار دارند (شیبانی، 1346).

بوته هندوانه  (citrullus lanatus)گیاهی است یکساله از خانواده کدوئیان که دارای شاخه‌های خزنده می‌باشد. برگ بوته هندوانه تقریباً قلبی شکل و دارای بریدگی­های عمیق است و اغلب این بریدگی اصلی دارای بریدگی­های فرعی یا ثانوی می­باشد. گل­های نر و ماده همیشه از هم جدا هستند ولی روی یک پایه قرار دارند (شیبانی، 1346).

انواع کدوها از جنس Cucurbita و از خانواده Cucurbitaceae می‌باشند. این گیاهان مانند سایر جنس­های این خانواده یک پایه و گرمسیری و اغلب یکساله هستند و انواع کدوهای اهلی که میوه آنها مورد استفاده انسان قرار می‌گیرد از سه گونه مشخص مشتق می‌شـوند که عبارتنـد از: 1- Cucurbita pepo. 2- Cucurbita moschata. 3- Cucurbita maxima. انواع کدوهای ایران نیز که به سه دسته تقسیم می‌شوند از سه جنس نامبرده هستند به این ترتیب که کدوی مسمایی از نوع   C. pepo و کدوی حلوایی یا رشتی از نوع C. moschata و کدوتنبل از نوع C. maxima هستند (شیبانی، 1346).

2-1- اهمیت محصولات جالیزی

صیفی‌جات گروه بسیار متنوعی از گونه­ های گیاهی را تشکیل می­ دهند که در سراسر جهان در شرایط مختلف و با هدف‌های گوناگون پرورش داده می­شوند. انواع زراعی مهم شامل خیار، خربزه (گرمک، خربزه قندک و غیره)، هندوانه و کدو هستند. انواع زراعی کم­اهمیت­تر شامل کایوت^[1]، سیترون^[2] (بادرنگ)، خیارترشی، کدوقلیانی، خیارشاخی^[3] و خیار وحشی است. تمام صیفی‌جات به سرما حساس‌اند، اما از لحاظ توانایی تحمل سرما و گرما متفاوتند. در زمین­های پست و کوه­ها، مزارع و گلخانه‌ها، مناطق گرمسیر، بیابانی و معتدل می‌رویند. بیشتر آنها رونده هستند اما برخی ارقام زراعی جدید کدو و خیار گیاهان فشرده بوته مانند تولید می‌کنند. میوه نارس یا رسیده صیفی‌جات به شکل تازه یا پخته مصرف می‌شوند. میوه­ های صیفی‌جات ارزش غذایی نسبتاً اندکی دارند؛ مهمترین اجزای تشکیل دهنده آنها ویتامین­ها و مواد معدنی هستند. میوه­ های گیاهان صیفی معمولاً بدون چربی­اند و سدیم اندک دارند. به استثنای میوه کدو حلوایی، سایر میوه‌های صیفی آب فراوان و ارزش کالری پایین دارند. خربزه، هندوانه و کدوی حلوایی منابع خوب ویتامین A هستند. خربزه و کدو مسمایی زرد منابع خوب ویتامین C هستند. Cucurbitacin‌ها که بیش از 20 شکل دارند، در ریشه‌ها، برگ­ها و میوه‌های گیاهان صیفی یافت می‌شوند. این ترکیبات بسیار سمی‌اند و به خیار، خربزه و کدو طعم تند می‌دهند. این ترکیبات در حفاظت از صیفی‌جات در برابر حشرات و علفخوارها، اهمیت زیادی دارند (امیر اصلانی، 1384).

3-1- سطح زیرکشت

حدود 326 هزار هکتار برابر با 7/2 درصد از برداشت اراضی محصولات زراعی کشور در سال زراعی 90-1389 به انواع محصولات جالیزی اختصاص داشته است. از این مقدار 7/95 درصد آن به صورت آبی و 4/4 درصد بقیه به صورت دیم بوده است. در این گروه، محصولات هندوانه با 44 درصد، خربزه با 8/24 درصد و خیار با 5/19 درصد را به خود اختصاص داده­اند. بیش از نیمی (8/59) از سطح این محصولات در پنج استان خراسان رضوی با 7/17 درصد، کرمان با 7/13 درصد، فارس با 5/11 درصد، خوزستان با 1/9 درصد و سیستان و بلوچستان با 9/7 درصد برداشت گردیده است. کمترین سطح این گروه از محصولات متعلق به استان اردبیل با 02/0 درصد است. استان گلستان نیز به علت شرایط جغرافیایی مناسب از سطح زیر کشت انواع گیاهان جالیزی برخوردار است (جدول 1-1) (آمار نامه کشاورزی، 1390).

4-1- بیماری­های ویروسی جالیز

در میان بیماری­هایی که در مزارع جالیز شیوع دارند، بیماری­های ویروسی ویرانگرتر و کنترل آنها دشوارتر است. شیوع و شدت آنها متفاوت است و به روابط پیچیده بین عوامل بیماریزا، میزبان­ها، ناقل­ها، محیط و محل­های وقوع آنها بستگی دارد (زیتر، 1996). در پهنای جهان بیش از 50 ویروس و چهار ویروئید که آلوده‌کننده شماری از اعضای خانواده کدوئیان هستند، گزارش شده است. کمتر از نصف این ویروس­ها بیمارگرهای رایج کدوئیان و به لحاظ اقتصادی مهم می‌باشند (کوچارک و پورسیفول، 2001). بیشتر این ویروس­ها می‌توانند تعدادی از گونه‌های گیاهی متعلق به جنس‌ها و خانواده‌های گوناگون را آلوده کنند اما معدودی از آنها به تیره کدو محدود هستند. 26 ویروس به طور مکانیکی درون شیره گیاهان آلوده قابل انتقال و 9 ویروس (موزائیک خیار، موزائیک ماتلی سبز خیار، لکه برگی خیار، لکه نکروزی خربزه، موزائیک کدو، موزائیک تلفیریا، لکه حلقوی تنباکو، موزائیک خیار وحشی و موزائیک زرد زوکینی) بذرزاد هستند (زیتر، 1996).

بیش از 41 ویروس و چهار ویروئید به طور طبیعی و یا آزمایشگاهی یک یا چند گونه از کدوئیان را آلوده می­سازند از این میان 8 ویروس علائم موزائیک را تولید می­ کنند (هسو و همکاران، 2005). که در بین آنها ویروس موزائیک هندوانه (Watermelon mosaic virus, WMV) یکی از شایع­ترین ویروس­های کدوئیان می­باشد. ویروس WMV نخستین بار در 1965 توسط وب و اسکوت توصیف شد (پورسیفول و همکاران، 1984) و جزء اولین پوتی­ویروس­های کشف شده است که کدوئیان را آلوده می­ کند (وب و اسکوت، 1965).

شناسایی عوامل بیماریزای ویروسی و در صورت امکان شناسایی راهکارهای مناسب به منظور به حداقل رساندن تاثیر آنها بر کمیت و کیفیت کشت صیفی اهمیت دارد. ویروس WMV به عنوان یک بیمارگر مهم در مناطق مدیترانه­ای و معتدل شناخته شده است و تنوع بیولوژیکی آن بخوبی مورد مطالعه قرار گرفته است. اما تمایز سویه­ها و جدایه­های آن بویژه آنالیز­های تنوع و تکامل آن بطور جدی و دقیق با گسترش ابزار­های مولکولی در دو دهه اخیر مورد توجه قرار گرفته است (مورینو و همکاران، 2004). این بررسی­ها در مقیاس­های جهانی و یا قاره­ای و حتی ناحیه­ای می ­تواند راهگشای درک تکامل و توسعه پاتوژن، و نهایتا ارائه راهکار مناسب برای کنترل آن باشد. در داخل کشور هیچ بررسی بر روی نوترکیبی ویروس موزاییک هندوانه صورت نگرفته است لذا در این بررسی تعیین وقوع و محاسبه تنوع ژنتیکی و نوترکیبی در بین جدایه­های WMV، تعیین موقعیت تاکسونومیکی ویروس موزاییک هندوانه، تعیین نسبت جانشینی نامترادف (dN) بر جانشینی مترادف (dS) در ویروس موزاییک هندوانه و مقایسه شباهت­ها و تقاوت­های ناحیه cp جدایه­های WMV در سطح نوکلئوتیدی و آمینواسیدی هدف قرار گرفت.

1- Chayote

2- Citron

3- Horned cucumber

تعداد صفحه : 94

قیمت :14700 تومان

بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد

و در ضمن فایل خریداری شده به ایمیل شما ارسال می شود.

پشتیبانی سایت :        *       parsavahedi.t@gmail.com

در صورتی که مشکلی با پرداخت آنلاین دارید می توانید مبلغ مورد نظر برای هر فایل را کارت به کارت کرده و فایل درخواستی و اطلاعات واریز را به ایمیل ما ارسال کنید تا فایل را از طریق ایمیل دریافت کنید.

14,700 تومانافزودن به سبد خرید

—-

پشتیبانی سایت :       

*         parsavahedi.t@gmail.com