دانشگاه علم و فرهنگ
پایان‌نامه كارشناسی ارشد
رشته زیست شناسی سلولی تکوینی
عنوان:
مقایسه ی میزان وقوع آپوپتوزدر بافت بیضه ی موش نابالغ پس از استفاده از دو روش انجماد شیشه ای متفاوت
اساتید راهنما
دكتر بی‌تا ابراهیمی
دکتر عبدالحسین شاهوردی
شهریور ماه 1393
(در فایل دانلودی نام نویسنده موجود است)
تکه هایی از متن پایان نامه به عنوان نمونه :
(ممکن است هنگام انتقال از فایل اصلی به داخل سایت بعضی متون به هم بریزد یا بعضی نمادها و اشکال درج نشود ولی در فایل دانلودی همه چیز مرتب و کامل است)
فهرست مطالب
عنوان صفحه
| فصل اول: مقدمه | 1 |
| 1-1-مقدمه | 2 |
| 1-2-انجماد | 2 |
| 1-2-1-تاریخچه ی انجماد | 3 |
| 1-2-2-تکنیک های مختلف انجمادی | 3 |
| 1-2-2-1-انجماد آهسته | 4 |
| 1-2-2-2-انجماد شیشه ای | 5 |
| 1-2-3-محلول های انجمادی | 5 |
| 1-2-3-1-ضدیخ ها | 5 |
| 1-2-3-2-سرم | 7 |
| 1-2-4-تاثیرات انجماد بر بافت بیضه | 7 |
| 3- 1-3-پیوند | 9 |
| 4- 1-4-کشت | 10 |
| 5- 1-5-تغییرات ملکولی متاثر از انجماد | 11 |
| 1-5-1-آپوپتوزیس | 12 |
| 1-5-1-1-مسیر خارجی آپوپتوز و ژن های دخیل در آن | 13 |
| 1-5-1-2-مسیرداخلی آپوپتوز و ژنهای دخیل در آن | 14 |
| 1-5-1-3-P53 | 16 |
| 1-5-1-4-کاسپاز 3 | 17 |
| 1-6-هدف | 18 |
| 1-7-پرسش پژوهشی | 18 |
| 1-8-فرضیات | 18 |
| فصل دوم : مواد و روش ها | 19 |
| 2-1-تهیه ی بافت بیضه و گروه های مورد مطالعه | 20 |
| 2-2-انجماد شیشه ای بافت بیضه | 21 |
| 2-2-1-روش تهیه محیط پایه | 21 |
| 2-2-2-روش تهیه محلول های انجماد شیشه ای | 21 |
| 2-2-2-1-روش آماده سازی محلول انجمادی I | 21 |
| 2-2-2-2-روش آماده سازی محلول انجمادی II | 22 |
| 2-2-3-مراحل انجماد شیشه ای | 22 |
| 2-2-3-1-روش انجمادی I | 22 |
| 2-2-3-2-روش انجمادی II | 23 |
| 2-2-4-ذوب بافت بیضه | 23 |
| 2-2-4-1-روش تهیه محلول های ذوب | 23 |
| 2-2-4-2-مراحل ذوب | 23 |
| 2-5-مطالعات میکروسکوپی و بافت شناسی بافت بیضه | 24 |
| 2-6-بررسی آپوپتوز و بقا سلولی | 26 |
| 2-6-1-هضم مکانیکی و آنزیمی بافت بیضه | 26 |
| 2-6-1-1-هضم مکانیکی | 27 |
| 2-6-1-2-هضم آنزیمی | 27 |
| 2-6-1-3-خنثی سازی اثر آنزیم و بررسی بقا با بهره گرفتن از رنگ PI | 27 |
| 2-6-2-ارزیابی بقای سلولی به روش فلوسایتومتری | 28 |
| 2-6-3-بررسی آپوپتوز سلولی | 29 |
| 2 -7-کشت بافت بیضه | 30 |
| 2-7-1-آماده سازی آگار | 30 |
| 2-7-2-آماده سازی محیط کشت | 31 |
| 2-7-2-1-روش تهیه محیط RPMI | 31 |
| 2-7-3-کشت بافت بیضه | 32 |
| 2-8-ارزیابی ژن های آپوپتوزی | 32 |
| 2-8-1-نگهداری بافت در محلول RNA-later | 32 |
| 2-8-2-استخراج RNA با بهره گرفتن از ترایزول | 32 |
| 2-8-2-1-هموژن کردن بافت
2-8-2-2-مرحله ی جداسازی |
33
33 |
| 2-8-2-3-رسوب RNA | 33 |
| 2-8-2-4-شستشو RNA | 33 |
| 2-8-3-بررسی کیفی RNA های استخراج شده | 34 |
| 2-8-4-تیمار نمونهیRNA با بهره گرفتن از DNase1 جهت حذف آلودگی ژنومی | 34 |
| 2-8-5-سنتز cDNA | 35 |
| 2-8-6-پرایمر | 37 |
| 2-8-6-1-آماده سازی پرایمرها | 37 |
| 2-8-6-2-بررسی جایگاه اتصال پرایمرها | 39 |
| 2-8-7-الکتروفورز | 39 |
| 2-8-7-1-روش ساخت بافر50X TAE | 39 |
| 2-8-7-2-روش ساخت بافر X TAE1 | 40 |
| 2-8-7-3-طرز تهیه ی ژل آگارز | 40 |
| 2-8-7-4-بررسی آلودگی پرایمر | 40 |
| -8-7-4-بررسی کیفیت RNA | 41 |
| 2-8-8-بررسی گرادیانت دمایی پرایمر | 41 |
| 2-8-9 Real-Time PCR | 42 |
| 2-8-9-2-بررسی کمی بیان ژن با بهره گرفتن از روش Real-Time PCR | 43
|
| 2-9-آنالیز آماری داده | 44 |
| فصل سوم: نتایج | 45 |
| 3-1-بررسی مورفولوژی بافت بوسیله رنگ آمیزی هماتوکسیلین و ائوزین | 46 |
| 3-2-مقایسه بقای سلولی در گروه کنترل با گروه های انجمادی I و II بلافاصله پس از ذوب | 46 |
| 3-3-بررسی میزان وقوع آپوپتوز پس از کشت بافت بیضه | 47 |
| 3-3-1-ارزیابی میزان بقای سلولی طی کشت بافت بیضه | 47 |
| 3-3-2-آپوپتوز اولیه ی سلولی طی کشت بافت بیضه | 47 |
| 3-3-3-بررسی میزان وقوع آپوپتوز پس از کشت بافت بیضه | 48 |
| 3-3-4-نکروز بافتی طی کشت بافت بیضه | 48 |
| 3-4-بررسی بیان ژن های آپوپتوزی در سطح رونوشت | 49 |
| 3-4-1-بررسی بیان رونوشت ژن های دخیل در مسیر های آپوپتوزی | 49 |
| 3-4-2-Bax | 49 |
| 3-4-3-BCL2 | 49 |
| 3-4-4-نسبت بیان BAX به BCL2 | 50 |
| 3-4-5-Caspase3 | 50 |
| 3-4-6-Fas | 50 |
| 3-4-7-Fas Ligand | 51 |
| 3-4-8-P53 | 51 |
| 27- فصل چهارم: بحث | 66 |
| 4-1-کلیات | 67 |
| 4-2-بررسی های مورفولوژیک در ساعات مختلف کشت در گروه های مورد مطالعه | 68 |
| 4-3-بررسی بقا و آپوپتوز سلولی در گروه های مورد مطالعه | 69 |
| 4-4-بررسی بیان ژن های مرتبط با وقوع آپوپتوز در گروه های مورد مطالعه | 71 |
| 4-5-نتیجه گیری | 75 |
| 4-6-پیشنهادات | 76 |
فهرست جداول
عنوان صفحه
| جدول 2-1-مراحل رنگ آمیزی هماتوکسیلین ایوزین | 26 |
| جدول2-2-مشخصات پرایمرهای مورد استفاده | 39 |
| جدول 2-3-برنامه ی مورد استفاده جهت بررسی گرادیانت دمایی پرایمرها | 42 |
| جدول 3-1- میانگین بقای سلولی در گروه های کنترل، انجمادی I و انجمادی II | 53 |
| جدول3-2- میانگین بقای سلول ها در سه گروه کنترل، انجمادی I و انجمادی II در ساعت های مختلف | 53 |
| جدول 3-3- میانگین درصد آپوپتوز اولیه ی سلول ها در سه گروه کنترل، انجمادی I و انجمادی II در ساعت های مختلف کشت | 54 |
| جدول 3-4-میانگین درصد آپوپتوز ثانویه ی سلول ها در سه گروه کنترل، انجمادی I و انجمادی II در ساعت های مختلف کشت | 54 |
| جدول 3-5- میانگین درصد سلول های نکروتیک در سه گروه کنترل، انجمادی I و انجمادی II در ساعت های مختلف کشت | 55 |
| جدول 3-6-میزان بیان ژن Bax در سه گروه کنترل، انجمادی I و انجمادی II در ساعت های مختلف کشت | 55 |
| جدول 3-7-میزان بیان ژن BCL2 در سه گروه کنترل، انجمادی I و انجمادی II در ساعت های مختلف کشت53 | 56 |
| جدول3-8-نسبت بیان BAX به BCL2 در سه گروه کنترل، انجمادی I و انجمادی II در ساعت های مختلف کشت | 56 |
| جدول3-9-میزان بیان ژن Caspase3 در سه گروه کنترل، انجمادی I و انجمادی II در ساعت های مختلف کشت | 57 |
| جدول 3-10-میزان بیان ژن Fas در سه گروه کنترل، انجمادی I و انجمادی II در ساعت های مختلف کشت | 57 |
| جدول 3-11-میزان بیان ژنLigand Fas در سه گروه کنترل، انجمادی I و انجمادی II در ساعت های مختلف کشت | 58 |
| جدول 3-12- میزان بیان ژن P53 در سه گروه کنترل، انجمادی I و انجمادی II در ساعت های مختلف کشت | 58 |
فهرست اشکال
عنوان صفحه
| شکل 1-1-مسیرهای شرکت کننده در رخداد آپوپتوز | 16 |
| شکل2-1-ارزیابی بقای سلولی با روش فلوسایتومتری | 28 |
| شکل2-3-ارزیابی وقوع آپوپتوز | 30 |
| شکل3-1-داده های حاصل از آنالیز بقای سلولی با روش فلوسایتومتری در گروه های کنترل، انجمادی I و انجمادی II در زمان صفر | 59 |
| شکل3-2-داده های حاصل از آنالیز آپوپتوز سلولی با روش فلوسایتومتری در گروه های کنترل و انجمادی در ساعت صفر | 60 |
| شکل3-3-داده های حاصل از آنالیز آپوپتوز سلولی با روش فلوسایتومتری در گروه های کنترل و انجمادی در ساعت 3 پس از کشت | 61 |
| شکل3-4-داده های حاصل از آنالیز آپوپتوز سلولی با روش فلوسایتومتری در گروه های کنترل و انجمادی در ساعت 20 پس از کشت | 62 |
| شکل 3-5-بررسی مورفولوژیک بافت بیضه در گروه کنترل و گروه های انجمادی در زمان صفر بوسیله رنگ آمیزی هماتوکسیلین و ائوزین | 63 |
| شکل 3-6-بررسی مورفولوژیک بافت بیضه در گروه کنترل و گروه های انجمادی 3 ساعت پس ازکشت بوسیله رنگ آمیزی هماتوکسیلین و ائوزین | 64 |
| شکل 3-7- بررسی مورفولوژیک بافت بیضه در گروه کنترل و گروه های انجمادی 20 ساعت پس از کشت بوسیله رنگ آمیزی هماتوکسیلین و ائوزین | 65 |
چکیده
گرچه انجماد بافت بیضه روشی مناسب جهت حفظ باروری در کودکان مبتلا به سرطان است اما القای آپوپتوز و مرگ سلولی تحت تاثیر فرایند انجماد نکته ی مهمی است که باید مورد توجه قرار گیرد. هدف از انجام این پژوهش ارزیابی میزان آپوپتوز سلولی پس از انجماد شیشه ای بافت بیضه ی موش نابالغ با دو روش انجمادی مختلف و کشت کوتاه مدت آن است.
بافت های بیضه از موش های سوری نر نابالغ 7 روزه جدا شد و به طور تصادفی در سه گروه کنترل ، انجمادیI و انجمادی II تقسیم گردید. در گروه انجمادی I، بافت ها با بهره گرفتن از غلظت های افزایشی ضدیخ های DMSO و EG و در گروه انجمادی II، با بهره گرفتن از غلظت افزایشی ترکیب سوکروز و EG منجمد شدند. نمونه های انجمادی پس از ذوب همراه با نمونه ها ی کنترل به مدت 20 ساعت در محیط کشت RPMI حاوی 10% سرم KOSR کشت داده شدند. بلافاصله پس ازذوب (ساعت صفر) ،3 و 20 ساعت پس از کشت، مورفولوژی، بقای سلولی، میزان وقوع آپوپتوز سلولی و میزان بیان ژن ها آپوپتوزی (BAX, BCL2,Caspase3, Fas, Fas ligand,P53)، با بهره گرفتن از روش های میکروسکوپ نوری، آنالیز فلوسایتومتری و Real-Time PCR مورد بررسی قرار گرفت.
روش انجمادی I در مقایسه با روش انجمادی II از لحاظ حفظ یکپارچگی بافت و بقای سلولی مشابه نمونه ی کنترل بود. آپوپتوز اولیه ی سلولی نیز طی ساعات کشت در گروه های انجمادی به طور معناداری (P<0/05) کاهش یافت ولی آپوپتوز ثانویه ی سلولی در گروه های انجمادی در ساعت 3 پس از کشت در مقایسه با زمان صفر به طور معناداری (P<0/05) افزایش یافت در حالی که در ساعت 20 پس از کشت در صد سلول هایی که دچار آپوپتوز ثانویه شده بودند در گروه انجمادی I و گروه کنترل در مقایسه با گروه انجمادی II به طور معناداری (P<0/05) بالاتر بود. میزان بیان ژن BAX در گروه انجمادی I در مقایسه با گروه کنترل در طی ساعات کشت به طور معناداری (P<0/05) بالاتر بود. بیان ژن BCL2 در گروه های انجمادی در طی ساعات کشت کاهش یافت ولی این کاهش معنادار نبود. ژن Caspase3 در همه ی گروه ها در زمان 3و 20 در مقایسه با زمان صفر کاهش معناداری (P<0/05) را نشان داد. بیان ژن های Fasو Fas Ligand در ساعت 3 پس از کشت در گروه های انجمادی در مقایسه با زمان صفر افزایش معناداری (P<0/05) یافت. میزان بیان ژن p53 در گروه های کنترل و انجمادی I در ساعت 3 و 20 در مقایسه با زمان صفر کاهش معناداری (P<0/05) را نشان داد ولی بیان این ژن در گروه انجمادی II در طی فرایند کشت نسبتا ثابت بود.
با توجه به نتایج بدست آمده به نظر می رسد هر دو روش انجمادی به کار برده شده سبب وقوع مرگ سلولی از طریق مسیر نکروزی و آپوپتوزی می شوند، اما روش انجمادی I در مقایسه با روش انجمادی II مرگ سلولی را بیشتر از طریق آپوپتوز القا می کند تا نکروز. از سوی دیگر با توجه به تغییرات الگوی بیان ژن P53 در حین فرایند کشت در هر دو گروه انجمادی می توان نتیجه گرفت که رخداد آپوپتوز پس از انجماد در بافت بیضه مستقل از ژن P53 است.
کلمات کلیدی: بافت بیضه، انجماد شیشه ای، رخداد آپوپتوز
فصل اول
مقدمه و مروری بر مطالعات گذشته
1-1-مقدمه
به واسطه ی پیشرفت های امروزه در زمینه درمان بیماری سرطان، تعداد افراد بهبود یافته از آن به طور چشم گیری افزایش یافته است، به گونه ای که حدود 80% از کودکان مبتلا به سرطان که تحت درمان بوده اند، سلامتی خود را مجددا به دست آورده اند (1)، ولی با این وجود حدود یک سوم این کودکان به دلیل حساسیت بالای سلول های اسپرماتوگونی موجود در بیضه، دچار اختلال عملکرد سیستم باروری و ناباروری شده اند (2). بدلیل عدم امکان حفظ باروری از طریق انجماد اسپرم در کودکان نابالغ می توان از انجماد و نگهداری بافت بیضه با هدف پیوند بافت، کشت بافت و یا پیوند سلول های آن به عنوان یک استراتژی مناسب جهت حفظ باروری استفاده کرد (3). علاوه بر کودکان مبتلا به سرطان می توان از این روش، برای حفظ باروری در افراد بزرگسال (4)، افراد مبتلا به بیماری های سیستمیک و بیماری های خونی (5)، گنادکتومی ها (6)، سندرم کلاین فلتر (7)، کریپتورکیدیسم (8) و غیره استفاده کرد. از دیگر مزایای این روش حفظ منابع ژنتیکی حیوانات در معرض خطر انقراض است.
تعداد صفحه : 108
قیمت :14700 تومان
