پایان نامه ارشد:مطالعه و شناسایی سویه های باکتریایی تولیدکننده کوتیناز

دانشگاه تحصیلات تکمیلی صنعتی و فناوری پیشرفته

 دانشکده علوم و فناوری های نوین گروه بیوتکنولوژی

پایان نامه به عنوان یکی از الزامات جهت دریافت درجه کارشناسی ارشد

عنوان:

مطالعه و شناسایی سویه­ های باکتریایی تولیدکننده کوتیناز

استاد راهنما:

دکتر مجتبی مرتضوی

دکتر مسعود ترکزاده ماهانی

بهمن 1393

برای رعایت حریم خصوصی نام نگارنده پایان نامه درج نمی شود

(در فایل دانلودی نام نویسنده موجود است)

تکه هایی از متن پایان نامه به عنوان نمونه :

(ممکن است هنگام انتقال از فایل اصلی به داخل سایت بعضی متون به هم بریزد یا بعضی نمادها و اشکال درج نشود ولی در فایل دانلودی همه چیز مرتب و کامل است)

فهرست مطالب

عنوان                                   صفحه

 فصل اول  معرفی.. 1

1- 1- مقدمه. 2

1- 2- اهمیت و ضرورت تحقیق.. 2

1- 3- فرضیات واهداف تحقیق.. 4

 فصل دوم  مروری بر کلیات و تحقیقات پیشین.. 6

2- 1- کوتین.. 7

2- 1- 1- جداسازی کوتین.. 12

2- 1- 2- دپلیمریزاسیون کوتین.. 12

2- 1- 3- مونومرهای تشکیل دهنده کوتین.. 13

2- 3- آنزیم کوتیناز 16

2- 3- 1- کلون و بیان کوتیناز 18

2- 3- 2- ساختار کوتیناز 19

2- 3- 3- عملکرد کوتیناز 26

2- 3- 4- کاربردهای کوتیناز 27

2- 3- 5- استفاده از کوتیناز به عنوان یک بیوکاتالیست در محیطهای غیرمعمول. 29

2- 3- 6- عملکرد کوتیناز در واکنشه­ای هیدرولیزی و سنتزی.. 33

2- 3- 7- ترانس استریفیکاسیون. 35

2- 3- 8- پایداری کوتیناز 36

2- 3- 9- فرایندهای در حال توسعه: بیوراکتور کوتیناز 38

2- 3- 10- مکانیسم عمل کوتیناز 39

2- 3- 11- مقایسه­ آنزیم کوتیناز قارچی و باکتریایی.. 41

2- 4- نشانگرهای ژنتیکی.. 42

2- 5- نشانگرهای مورفولوژیکی.. 42

2- 6- نشانگرهای مولکولی.. 43

2- 7- نشانگرهای پروتئینی یا بیوشیمیایی.. 44

2- 8- نشانگرهای DNA.. 45

2- 8- 1- نشانگرهای DNA غیر مبتنی بر PCR.. 46

2- 8- 2- نشانگرهای مبتنی بر PCR.. 46

2- 9- نشانگرهای غیر اختصاصی.. 47

2- 9- 1- RAPD.. 47

2- 10- نشانگرهای اختصاصی.. 48

2- 10- 1- AFLP. 48

2- 10- 2- SSR.. 48

2- 10- 3- RFLP-PCR.. 50

2- 10- 4- RFLP Based PCR با اتصال ناقص… 51

 فصل سوم  مواد، تجهیزات و روش تحقیق.. 52

3- 1- استخراج کوتین.. 55

3- 2- نمونه برداری.. 55

3- 3- غربالگری و جداسازی گونه­های تولیدکننده آنزیم کوتیناز 55

3- 4- تهیه slant از سویه­های جدا شده 57

3- 5- نگهداری طولانی مدت سویه­ها 57

3- 6- تهیه گلیسرول. 58

3- 7- تهیه محیط کشتLB.. 58

3- 8- Assay آنزیمی.. 58

3- 9- Assay ویژه آنزیمی.. 60

3- 10- استخراج DNA.. 60

3- 10- 1- استخراج DNA  به روش جوشاندن. 60

3- 10- 2- استخراج DNA به رو ش CTAB.. 61

3- 10- 3- روش استخراج DNA با کیت.. 64

3- 11- اندازه ­گیری کیفیت و غلظت DNA.. 65

3- 12- رنگ آمیزی با اتیدیوم برماید. 69

3- 13- واكنش زنجیره ای پلیمراز Polymerase Chain Reaction. 70

3- 14- راه اندازی واکنش PCR.. 74

3- 15- برنامهPCRبرای نشانگرRAPD.. 76

3- 16- توالی­یابی سویه­های تولیدکننده آنزیم کوتیناز با بهره گرفتن از 16S rDNA.. 77

3- 17- الکتروفورز محصولات واکنش PCR.. 78

فصل چهارم. 80

4- 1- بررسی میزان کوتین در میوه­های مختلف.. 81

4- 2- جداسازی سویه­ها 87

4- 3- بررسی فعالیت آنزیم کوتیناز در نمونه­ها 87

4- 4- نتایج بررسی کیفیت DNA بعد از استخراج. 88

4- 5- تجزیه و تحلیل تنوع ژنتیکی 6 سویه بر اساس نشانگر مولکولی RAPD.. 89

4- 6- نتایج حاصل از تجزیه خوشه­ای بر اساس نشانگر RAPD.. 89

4- 7- تجزیه به مختصات اصلی.. 90

4- 8- نتایج تجزیه باندهای حاصل از 8 پرایمر RAPD.. 92

4- 9- ضریب همبستگی کوفنتیک… 93

4- 10- شناسایی و توالی یابی سویه­ها با بهره گرفتن از 16S rDNA.. 93

 فصل پنجم. 95

5- 1- استخراج کوتین.. 96

5- 2- سنجش فعالیت آنزیمی کوتیناز 97

5- 3- استخراج DNA.. 98

5- 4- تنوع ژنتیکی با بهره گرفتن از نشانگر RAPD.. 98

پیشنهادات.. 100

6- 1- پیشنهادات.. 101

فهرست جدول‌ها

جدول ‏2‑1 مطالعه ساختار- عملکرد کوتیناز به کمک تکنی­کهای مختلف… 24

جدول ‏2‑2 فعالیت هیدرولازی کوتیناز نسبت به تنوع گستردهای از سوبستراها 29

جدول ‏2‑3 روش­های آماده­سازی کوتیناز 30

جدول ‏3‑1 مواد مورد استفاده در پایان نامه . 53

جدول ‏3‑2 مشخصات کامل مواد شیمیایی مورد نیاز در عملیات استخراج DNA… 61

جدول ‏3‑3 مواد مورد استفاده برای تهیه بافر TBE(10X) 68

جدول ‏3‑4 مشخصات پرایمرهای RAPD… 73

جدول ‏3‑5 مواد مورد نیاز PCR.. 75

جدول ‏3‑6 مواد مورد نیاز PCR با مستر میکس اماده 76

جدول ‏3‑7 برنامه واکنش PCR مورد استفاده برای نشانگر RAPD… 76

جدول ‏3‑8 برنامه واکنش PCR برای پرایمرهای 16S rDNA.. 77

جدول ‏3‑9 مواد مورد نیاز برای انجام PCR 6 نمونه با پرایمرهای16S rDNA.. 78

جدول‏3‑10 16S rDNA primer. 78

جدول ‏4‑1بررسی میزان کوتین.. 82

جدول ‏4‑2 بررسی میزان کوتین در خیارسبز. 83

جدول ‏4‑3 بررسی میزان کوتین در سیب زرد. 84

جدول ‏4‑4 بررسی میزان کوتین در سیب قرمز. 85

جدول ‏4‑5 تجزیه واریانس وزن کوتین نهایی بین میوه­ها 85

جدول‏4‑6 مقایسه میانگین میوه­ها به روش دانکن در سطح احتمال 1% برای صفت وزن کوتین نهایی.. 86

جدول ‏4‑7 فعالیت کوتینازی 6 نمونه. 88

جدول ‏4‑8  نتایج پرایمرهای RAPD حاصل از الکتروفورز افقی نمونه­ها 89

فهرست شکل‌ها

شکل ‏2‑1 ترسیم نمای ساختمان پوستک گیاه A) مرحله گستردگی کامل برگ B) تصویری با میکروسکوپ الکترونی از پوستک برگ بزرگنمایی 51000 برابر. 9

‏2‑2 مولکول کوتین و مونومرهایی که از هیدرولیز آن بدست می آید. 10

شکل ‏2‑3 نمایش شماتیکی از کوتیکول.. 11

شکل ‏2‑4 a) ساختمان غیر مشخص و بینظم کوتیکول با میکروسکوپ الکترونی b) برآمدگی­های کوتین میوه گوجه­فرنگی با میکروسکوپ الکترونی.. 11

شکل ‏2‑5 a) توالی پروتئینی آنزیم کوتیناز b) مکانیسم عمل آنزیم کوتیناز 16

شکل ‏2‑6 هیدرولاز آلفا و بتا 20

شکل ‏2‑7 ساختار کوتیناز 21

شکل ‏2‑8 توانایی تجزیه (a) و سنتز(b) ترکیبات پلی استری توسط آنزیم کوتیناز 28

شکل‏2‑9 مکانیسم عمل کوتیناز 40

‏2‑10 گسترهی مقاومت آنزیم کوتیناز در برابر دما وpH 41

شکل ‏2‑11نمودار دما و pH… 41

شکل ‏2‑12 دسته­بندی نشانگرهای ژنتیکی.. 44

شکل ‏3‑1 تهیه ژل آگارز 68

شکل ‏4‑1مراحل مختلف استخراج کوتین در گوجه­فرنگی.. 81

شکل ‏4‑2 مراحل مختلف استخراج کوتین در خیارسبز. 82

شکل ‏4‑3 مراحل مختلف استخراج کوتین در سیب زرد. 83

شکل ‏4‑4 مراحل مختلف استخراج کوتین در سیب قرمز. 84

شکل ‏4‑5 مقایسه میزان کوتین.. 86

شکل ‏4‑6 میزان فعالیت سویه­ها 88

شکل ‏4‑7 دندروگرام حاصل از تجزیه خوشهای 9 پرایمر RAPD با روش UPGMA… 90

شکل ‏4‑8 پلات دوبعدی حاصل از تجزیه به مولفه­های اصلی نشانگر RAPD… 91

شکل ‏4‑9پلات سه بعدی حاصل از تجزیه به مولفه­های اصلی نشانگر RAPD… 92

شکل ‏4‑10 ژل الکتروفورز افقی با آگارز 1% با بهره گرفتن از پرایمرها 93

شکل ‏4‑11ژل الکتروفورز با آگارز 1% با پرایمرهای 16S rDNA.. 94

چکیده

کوتیناز یک آنزیم هیدرولازی است که کوتین را تجزیه می­ کند. کوتین گیاهان عالی از ترکیبات پلی­استری هیدروکسی و اپوکسی اسیدچرب تشکیل شده که عمدتا توسط باندهای استری پیوند یافته­اند. اسیدهای چرب کوتین معمولا n-c16 و n-c18 هستند و حاوی یک تا سه گروه هیدروکسیل هستند. کوتین نقش کلیدی درحفاظت از گیاهان در برابر عوامل بیماریزا ایفا می کند و تجزیه­ی آنزیمی آن اولین گام در فرآیند آلودگی بافت گیاهی است. هدف از این پژوهش استخراج کوتین و مقایسه­ آنها در میوه­های مختلف و غربالگری باکتری­ها و قارچ­های تولید کننده آنزیم کوتیناز و شناسایی گونه آنها با تعیین توالی ناحیه   16S DNA می­باشد. با توجه به اهمیت آنزیم کوتیناز به ویژه در صنعت، این مطالعه گامی مهم در شناسایی سویه­های بومی تولید کننده آنزیم کوتیناز و استفاده از آنها در صنعت به شمار می­آید. بدین منظور پوست میوه­های مختلف را جمع­آوری و در بافر اگزالات جوشانده و بعد از شست­و­شو در آون خشک شده و آسیاب گردید. از پودر حاصل به روش کلرفرم متانول کوتین آن جداسازی شد. نتایج نشان می­داد که درصد کوتین استخراج شده در سیب بیشتر است و احتمالا سیب نسبت به آفات و بیماری­ها مقاوم­تر است. در مرحله­ی بعد جداسازی سویه­ای تولیدکننده آنزیم از نمونه­های مختلف انجام شد. نمونه­ها به داخل پلیت های حاوی محیط کشتی که کوتین تنها منبع کربن است تلقیح داده و سویه­های غربالگری شده و به کمک سوبسترای اختصاصی پارانیتروفنول بوتیرات فعالیت کوتینازی سنجیده شد. به منظور بررسی تنوع ژنتیکی 6 سویه جداسازی شده با بهره گرفتن از نشانگر RAPD مورد مطالعه قرار گرفتند. به این منظورDNA ژنومی از سویه­های تولیدکننده آنزم کوتیناز به روش جوشاندن، CTAB و کیت استخراج شد و واکنش PCR با بهره گرفتن از 9 آغازگر  RAPD انجام گردید. برای شناسایی و توالی یابی سویه­ها با بهره گرفتن از rDNA 16S  عمل PCR  با دو پرایمر 8F و  1541Rانجام شد سپس محصولات PCR برای توالی یابی ارسال شد. این مطالعات نشان می­دهد که سویه­های جداسازی شده دارای فعالیت کوتینازی مناسبی بوده و میزان بالایی از آنزیم کوتیناز را تولید می­ کنند که قابلیت مصارف تجاری صنعتی دارند.

كلمات كلیدی: کوتین، آنزیم کوتیناز، سنجش فعالیت آنزیمی، تنوع ژنتیکی، نشانگر RAPD

1فصل اول
معرفی

1- 1- مقدمه

استفاده از پلیمرهای گیاهی توسط میکروارگانیسم­ها مستلزم ترشح آنزیم­های هیدرولازی است که مهم­ترین آنها کوتیناز می­باشد. کوتیناز توانایی هیدرولیز انواع استرها و پلی­استرهای کوچک را داراست. کوتیناز یک آنزیم هیدرولازی است که کوتین را تجزیه می­ کند. کوتین در بیشتر گیاهان وجود دارد و دارای ترکیبات پلی استری هیدروکسی و اپوکسی اسیدچرب است [1]. کوتین یک پلی استر بسیار هیدروفوب غیر محلول در آب و از مشتقات گاما هیدروکسی اسیدچرب می­باشد که در ساختار کوتیکول گیاهان وجود دارد [2]. اصطلاح کوتین از کوتوس^[1] گرفته شده و این اصطلاح در اصل برای توصیف ماده­ای است که بخشی از اپیدرم برگ را تشکیل داده و در برابر اسیدهای قوی مقاوم است. کوتین در بیشتر گیاهان وجود دارند. مطالعات بر روی کوتین و کوتیکول گیاه از قرن نوزده آغاز شده است. حتی گیاهان عالی که در زیر آب زندگی می­ کنند مانند چمن­دریا^[2]، زئوسترا­ مارینا^[3] دارای کوتین هستند و مونومرهایی از همان نوع مونومرهایی که در بقیه­ی گیاهان یافت می­شود دارند.کوتین گیاهان عالی از ترکیبات پلی­استری هیدروکسی و اپوکسی­اسیدچرب تشکیل شده که عمدتا توسط باندهای استری پیوند یافته­اند[3]. اسیدهای چرب کوتین معمولا n-c16 و n-c18 بوده و دارای یک تا سه گروه هیدروکسیل هستند. کوتین نقشی کلیدی در حفاظت از گیاه در برابر عوامل بیماری­زا ایفا می­ کند [4] و تجزیه­ی آنزیمی آن یکی از اولین گام­ها در فرآیند آلودگی است. در واقع کوتیکول یک لایه­ی محافظ چربی­دوست است که برگ­ها، ساقه­ها و میوه­ها را می­پوشاند. بر روی کوتیکول لایه­ای از موم پوشیده شده است که علاوه بر اینکه مانع از تبخیر آب گیاه می­شود در برابر عوامل بیماری­زا و آفات نیز از گیاه حفاظت می­ کند. استفاده از آنزیم کوتیناز باعث افزایش اثرات دارویی مواد شیمیایی كشاورزی شده و همچنین كوتیناز به عنوان یك آنزیم لیپولیتیك در مواد شوینده لباس و ظرف برای چربی زدایی به كار رفته است. تجزیه­ی پلاستیك­ها از قبیل پلی­استرهای مصنوعی، محصولات محلول در آب با بهره گرفتن از كوتیناز بدست آمده است.

تعداد صفحه : 125

قیمت :14700 تومان

بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد

و در ضمن فایل خریداری شده به ایمیل شما ارسال می شود.

پشتیبانی سایت :        *       asa.goharii@gmail.com

در صورتی که مشکلی با پرداخت آنلاین دارید می توانید مبلغ مورد نظر برای هر فایل را کارت به کارت کرده و فایل درخواستی و اطلاعات واریز را به ایمیل ما ارسال کنید تا فایل را از طریق ایمیل دریافت کنید.