دانشگاه تحصیلات تکمیلی صنعتی و فناوری پیشرفته
دانشکده علوم و فناوری های نوین گروه بیوتکنولوژی
پایان نامه به عنوان یکی از الزامات جهت دریافت درجه کارشناسی ارشد
عنوان:
مطالعه و شناسایی سویه های باکتریایی تولیدکننده کوتیناز
استاد راهنما:
دکتر مجتبی مرتضوی
دکتر مسعود ترکزاده ماهانی
بهمن 1393
(در فایل دانلودی نام نویسنده موجود است)
تکه هایی از متن پایان نامه به عنوان نمونه :
(ممکن است هنگام انتقال از فایل اصلی به داخل سایت بعضی متون به هم بریزد یا بعضی نمادها و اشکال درج نشود ولی در فایل دانلودی همه چیز مرتب و کامل است)
فهرست مطالب
عنوان صفحه
فصل دوم مروری بر کلیات و تحقیقات پیشین.. 6
2- 1- 2- دپلیمریزاسیون کوتین.. 12
2- 1- 3- مونومرهای تشکیل دهنده کوتین.. 13
2- 3- 1- کلون و بیان کوتیناز 18
2- 3- 5- استفاده از کوتیناز به عنوان یک بیوکاتالیست در محیطهای غیرمعمول. 29
2- 3- 6- عملکرد کوتیناز در واکنشهای هیدرولیزی و سنتزی.. 33
2- 3- 7- ترانس استریفیکاسیون. 35
2- 3- 9- فرایندهای در حال توسعه: بیوراکتور کوتیناز 38
2- 3- 10- مکانیسم عمل کوتیناز 39
2- 3- 11- مقایسه آنزیم کوتیناز قارچی و باکتریایی.. 41
2- 5- نشانگرهای مورفولوژیکی.. 42
2- 7- نشانگرهای پروتئینی یا بیوشیمیایی.. 44
2- 8- 1- نشانگرهای DNA غیر مبتنی بر PCR.. 46
2- 8- 2- نشانگرهای مبتنی بر PCR.. 46
2- 9- نشانگرهای غیر اختصاصی.. 47
2- 10- 4- RFLP Based PCR با اتصال ناقص… 51
فصل سوم مواد، تجهیزات و روش تحقیق.. 52
3- 3- غربالگری و جداسازی گونه های تولیدکننده آنزیم کوتیناز 55
3- 4- تهیه slant از سویههای جدا شده 57
3- 5- نگهداری طولانی مدت سویهها 57
3- 10- 1- استخراج DNA به روش جوشاندن. 60
3- 10- 2- استخراج DNA به رو ش CTAB.. 61
3- 10- 3- روش استخراج DNA با کیت.. 64
3- 11- اندازه گیری کیفیت و غلظت DNA.. 65
3- 12- رنگ آمیزی با اتیدیوم برماید. 69
3- 13- واكنش زنجیره ای پلیمراز Polymerase Chain Reaction. 70
3- 14- راه اندازی واکنش PCR.. 74
3- 15- برنامهPCRبرای نشانگرRAPD.. 76
3- 16- توالییابی سویههای تولیدکننده آنزیم کوتیناز با بهره گرفتن از 16S rDNA.. 77
3- 17- الکتروفورز محصولات واکنش PCR.. 78
4- 1- بررسی میزان کوتین در میوه های مختلف.. 81
4- 3- بررسی فعالیت آنزیم کوتیناز در نمونه ها 87
4- 4- نتایج بررسی کیفیت DNA بعد از استخراج. 88
4- 5- تجزیه و تحلیل تنوع ژنتیکی 6 سویه بر اساس نشانگر مولکولی RAPD.. 89
4- 6- نتایج حاصل از تجزیه خوشهای بر اساس نشانگر RAPD.. 89
4- 7- تجزیه به مختصات اصلی.. 90
4- 8- نتایج تجزیه باندهای حاصل از 8 پرایمر RAPD.. 92
4- 9- ضریب همبستگی کوفنتیک… 93
4- 10- شناسایی و توالی یابی سویهها با بهره گرفتن از 16S rDNA.. 93
5- 2- سنجش فعالیت آنزیمی کوتیناز 97
5- 4- تنوع ژنتیکی با بهره گرفتن از نشانگر RAPD.. 98
فهرست جدول‌ها
جدول 2‑1 مطالعه ساختار- عملکرد کوتیناز به کمک تکنیکهای مختلف… 24
جدول 2‑2 فعالیت هیدرولازی کوتیناز نسبت به تنوع گستردهای از سوبستراها 29
جدول 2‑3 روشهای آماده سازی کوتیناز 30
جدول 3‑1 مواد مورد استفاده در پایان نامه . 53
جدول 3‑2 مشخصات کامل مواد شیمیایی مورد نیاز در عملیات استخراج DNA… 61
جدول 3‑3 مواد مورد استفاده برای تهیه بافر TBE(10X) 68
جدول 3‑4 مشخصات پرایمرهای RAPD… 73
جدول 3‑5 مواد مورد نیاز PCR.. 75
جدول 3‑6 مواد مورد نیاز PCR با مستر میکس اماده 76
جدول 3‑7 برنامه واکنش PCR مورد استفاده برای نشانگر RAPD… 76
جدول 3‑8 برنامه واکنش PCR برای پرایمرهای 16S rDNA.. 77
جدول 3‑9 مواد مورد نیاز برای انجام PCR 6 نمونه با پرایمرهای16S rDNA.. 78
جدول 4‑1بررسی میزان کوتین.. 82
جدول 4‑2 بررسی میزان کوتین در خیارسبز. 83
جدول 4‑3 بررسی میزان کوتین در سیب زرد. 84
جدول 4‑4 بررسی میزان کوتین در سیب قرمز. 85
جدول 4‑5 تجزیه واریانس وزن کوتین نهایی بین میوه ها 85
جدول4‑6 مقایسه میانگین میوه ها به روش دانکن در سطح احتمال 1% برای صفت وزن کوتین نهایی.. 86
جدول 4‑7 فعالیت کوتینازی 6 نمونه. 88
جدول 4‑8 نتایج پرایمرهای RAPD حاصل از الکتروفورز افقی نمونه ها 89
فهرست شکل‌ها
2‑2 مولکول کوتین و مونومرهایی که از هیدرولیز آن بدست می آید. 10
شکل 2‑3 نمایش شماتیکی از کوتیکول.. 11
شکل 2‑5 a) توالی پروتئینی آنزیم کوتیناز b) مکانیسم عمل آنزیم کوتیناز 16
شکل 2‑6 هیدرولاز آلفا و بتا 20
شکل 2‑8 توانایی تجزیه (a) و سنتز(b) ترکیبات پلی استری توسط آنزیم کوتیناز 28
شکل2‑9 مکانیسم عمل کوتیناز 40
2‑10 گسترهی مقاومت آنزیم کوتیناز در برابر دما وpH 41
شکل 2‑12 دستهبندی نشانگرهای ژنتیکی.. 44
شکل 4‑1مراحل مختلف استخراج کوتین در گوجه فرنگی.. 81
شکل 4‑2 مراحل مختلف استخراج کوتین در خیارسبز. 82
شکل 4‑3 مراحل مختلف استخراج کوتین در سیب زرد. 83
شکل 4‑4 مراحل مختلف استخراج کوتین در سیب قرمز. 84
شکل 4‑5 مقایسه میزان کوتین.. 86
شکل 4‑6 میزان فعالیت سویهها 88
شکل 4‑7 دندروگرام حاصل از تجزیه خوشه ای 9 پرایمر RAPD با روش UPGMA… 90
شکل 4‑8 پلات دوبعدی حاصل از تجزیه به مولفههای اصلی نشانگر RAPD… 91
شکل 4‑9پلات سه بعدی حاصل از تجزیه به مولفههای اصلی نشانگر RAPD… 92
شکل 4‑10 ژل الکتروفورز افقی با آگارز 1% با بهره گرفتن از پرایمرها 93
شکل 4‑11ژل الکتروفورز با آگارز 1% با پرایمرهای 16S rDNA.. 94
چکیده
کوتیناز یک آنزیم هیدرولازی است که کوتین را تجزیه می کند. کوتین گیاهان عالی از ترکیبات پلیاستری هیدروکسی و اپوکسی اسیدچرب تشکیل شده که عمدتا توسط باندهای استری پیوند یافتهاند. اسیدهای چرب کوتین معمولا n-c16 و n-c18 هستند و حاوی یک تا سه گروه هیدروکسیل هستند. کوتین نقش کلیدی درحفاظت از گیاهان در برابر عوامل بیماریزا ایفا می کند و تجزیهی آنزیمی آن اولین گام در فرایند آلودگی بافت گیاهی است. هدف از این پژوهش استخراج کوتین و مقایسه آنها در میوه های مختلف و غربالگری باکتری ها و قارچهای تولید کننده آنزیم کوتیناز و شناسایی گونه آنها با تعیین توالی ناحیه 16S DNA میباشد. با توجه به اهمیت آنزیم کوتیناز به ویژه در صنعت، این مطالعه گامی مهم در شناسایی سویههای بومی تولید کننده آنزیم کوتیناز و استفاده از آنها در صنعت به شمار میآید. بدین منظور پوست میوه های مختلف را جمع آوری و در بافر اگزالات جوشانده و بعد از شستوشو در آون خشک شده و آسیاب گردید. از پودر حاصل به روش کلرفرم متانول کوتین آن جداسازی شد. نتایج نشان میداد که درصد کوتین استخراج شده در سیب بیشتر است و احتمالا سیب نسبت به آفات و بیماریها مقاومتر است. در مرحله بعد جداسازی سویهای تولیدکننده آنزیم از نمونه های مختلف انجام شد. نمونه ها به داخل پلیت های حاوی محیط کشتی که کوتین تنها منبع کربن است تلقیح داده و سویههای غربالگری شده و به کمک سوبسترای اختصاصی پارانیتروفنول بوتیرات فعالیت کوتینازی سنجیده شد. به منظور بررسی تنوع ژنتیکی 6 سویه جداسازی شده با بهره گرفتن از نشانگر RAPD مورد مطالعه قرار گرفتند. به این منظورDNA ژنومی از سویههای تولیدکننده آنزم کوتیناز به روش جوشاندن، CTAB و کیت استخراج شد و واکنش PCR با بهره گرفتن از 9 آغازگر RAPD انجام گردید. برای شناسایی و توالی یابی سویهها با بهره گرفتن از rDNA 16S عمل PCR با دو پرایمر 8F و 1541Rانجام شد سپس محصولات PCR برای توالی یابی ارسال شد. این مطالعات نشان میدهد که سویههای جداسازی شده دارای فعالیت کوتینازی مناسبی بوده و میزان بالایی از آنزیم کوتیناز را تولید می کنند که قابلیت مصارف تجاری صنعتی دارند.
كلمات كلیدی: کوتین، آنزیم کوتیناز، سنجش فعالیت آنزیمی، تنوع ژنتیکی، نشانگر RAPD
1فصل اول
معرفی
1- 1- مقدمه
استفاده از پلیمرهای گیاهی توسط میکروارگانیسمها مستلزم ترشح آنزیم های هیدرولازی است که مهمترین آنها کوتیناز میباشد. کوتیناز توانایی هیدرولیز انواع استرها و پلیاسترهای کوچک را داراست. کوتیناز یک آنزیم هیدرولازی است که کوتین را تجزیه می کند. کوتین در بیشتر گیاهان وجود دارد و دارای ترکیبات پلی استری هیدروکسی و اپوکسی اسیدچرب است [1]. کوتین یک پلی استر بسیار هیدروفوب غیر محلول در آب و از مشتقات گاما هیدروکسی اسیدچرب میباشد که در ساختار کوتیکول گیاهان وجود دارد [2]. اصطلاح کوتین از کوتوس[1] گرفته شده و این اصطلاح در اصل برای توصیف مادهای است که بخشی از اپیدرم برگ را تشکیل داده و در برابر اسیدهای قوی مقاوم است. کوتین در بیشتر گیاهان وجود دارند. مطالعات بر روی کوتین و کوتیکول گیاه از قرن نوزده آغاز شده است. حتی گیاهان عالی که در زیر آب زندگی می کنند مانند چمندریا[2]، زئوسترا مارینا[3] دارای کوتین هستند و مونومرهایی از همان نوع مونومرهایی که در بقیه گیاهان یافت می شود دارند.کوتین گیاهان عالی از ترکیبات پلیاستری هیدروکسی و اپوکسیاسیدچرب تشکیل شده که عمدتا توسط باندهای استری پیوند یافتهاند[3]. اسیدهای چرب کوتین معمولا n-c16 و n-c18 بوده و دارای یک تا سه گروه هیدروکسیل هستند. کوتین نقشی کلیدی در حفاظت از گیاه در برابر عوامل بیماریزا ایفا می کند [4] و تجزیهی آنزیمی آن یکی از اولین گامها در فرایند آلودگی است. در واقع کوتیکول یک لایهی محافظ چربیدوست است که برگها، ساقهها و میوه ها را میپوشاند. بر روی کوتیکول لایهای از موم پوشیده شده است که علاوه بر اینکه مانع از تبخیر آب گیاه می شود در برابر عوامل بیماریزا و آفات نیز از گیاه حفاظت می کند. استفاده از آنزیم کوتیناز باعث افزایش اثرات دارویی مواد شیمیایی كشاورزی شده و همچنین كوتیناز به عنوان یک آنزیم لیپولیتیک در مواد شوینده لباس و ظرف برای چربی زدایی به كار رفته است. تجزیهی پلاستیكها از قبیل پلیاسترهای مصنوعی، محصولات محلول در آب با بهره گرفتن از كوتیناز بدست آمده است.
تعداد صفحه : 125
قیمت :14700 تومان
بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد
و در ضمن فایل خریداری شده به ایمیل شما ارسال می شود.
پشتیبانی سایت : * parsavahedi.t@gmail.com
در صورتی که مشکلی با پرداخت آنلاین دارید می توانید مبلغ مورد نظر برای هر فایل را کارت به کارت کرده و فایل درخواستی و اطلاعات واریز را به ایمیل ما ارسال کنید تا فایل را از طریق ایمیل دریافت کنید.
14,700 تومانافزودن به سبد خرید