دانشگاه شیراز
دانشكده مهندسی
پایان نامه كارشناسی ارشد در رشته مهندسی شیمی
شبیه سازی و بهینه سازی راكتور بیولوژیكی تولیدكننده بوتانول
استاد راهنما:
دکتر رضا اسلاملوئیان
(در فایل دانلودی نام نویسنده موجود است)
تکه هایی از متن پایان نامه به عنوان نمونه :
(ممکن است هنگام انتقال از فایل اصلی به داخل سایت بعضی متون به هم بریزد یا بعضی نمادها و اشکال درج نشود ولی در فایل دانلودی همه چیز مرتب و کامل است)
چکیده
تخمیر نیمه پیوسته، روشی کارا و سودمند جهت تولید محصولات متابولیکی ارزشمند مانند سوخت های زیستی می باشد. مدلسازی ریاضی بیوراکتورهای نیمه پیوسته با توجه به طبیعت گذرا و ناپایای تخمیر و همچنین پیچیدگی متابولیسم سلولی، مسأله ای بسیار دشوار و پیچیده است. در این زمینه برخی از محققین مدل هایی ساخت یافته ارائه کرده اند که نسبت به مدل های غیر ساخت یافته دقت و بازده بیشتری دارند. در این تحقیق، مدل ساختار یافته دقیق و کارای موازنة فلاکس پویا برای توصیف رفتار باکتری کلستریدیوم استوبوتیلیکوم) (clostridium acetobutylicum مطرح شده است. این مدل حاصل تلفیق مدل پایای متابولیسم درون سلولی و معادلات موازنة جرم پویا بر روی اجزای اصلی برون سلولی می باشد. مدل پویای مذکور بر پایة شبکة متابولیکی بازسازی شدة 824_cellb بیان شده است. در مدلسازی فرایند تخمیر نیمه پیوسته، جهت همبستگی تولید بوتانول و رشد میکروارگانیسم، ژن های CoATدر مدل 824_cellb حذف شده و ژن AAD بیش از حالت طبیعی بیان شده و شرایط اولیه و پارامترهای عملیاتی بهینه برای تولید بیشینه محصول مطلوب، مورد استفاده قرار گرفته است. این پارامترها عبارتند از: زمان نهایی عملیات، حجم اولیه راکتور و دبی خوراک ورودی. روند كلی عملیات نیمه‌پیوسته به دو فاز عملیاتی اسیدی (جهت رشد و تكثیر باكتری‌ها از غلظت كم تا غلظتی قابل توجه) و خنثی (جهت افزایش غلظت توده زیستی و جهت افزایش تولید بوتانول) با نرخ خوراك ورودی ثابت تقسیم‌بندی شده است. بهینه سازی در حالت نیمه پیوسته صورت گرفته است. شایان ذكر است كه نتایج به خوبی اهمیت حدف ژن و بیان بیش از حد ژن را در تعیین شرایط عملیاتی فرایندهای نیمه پیوسته نشان می دهد، در واقع می توان گفت كه حدف ژن و بیان بیش از حد ژن در شرایط بی هوازی با حفظ سایر پارامترها نسبت به حالت بهینه، موجب افزایش میزان محصول مطلوب(بوتانل) و کاهش میزان تولید محصول نامطلوب(اتانول و استون) خواهد شد. استفاده از مدلهای ساختار یافته مبتنی بر آنالیز موازنه فلاکس، بدون نیاز به اطلاعات سینتیکی آنزیمی، قادر به مدلسازی دقیق رفتار میکرو ارگانیسم ها می باشند.
فهرست
عنوان……. صفحه
1- مقدمه. 2
1- 1- مقدمه‌ای بر بیوتكنولوژی.. 2
1-2- بیوتكنولوژی- یك هسته مركزی با دو جزء 4
1-3- مقدمه‌ای بر فرآیندهای تخمیری.. 5
1-3-1- بخش‌های اصلی فرایند تخمیری.. 7
1-3-2- محیط كشت تخمیر صنعتی.. 8
2- مروری بر كارهای گذشته. 11
2-1- مروری بر كاربردهای كشت نیمه‌پیوسته (غیر مداوم خوراك‌دهی شده) 11
2-2- مروری بر تولید بوتانل از طریق كشت میكروبی.. 13
2-3- مروری بر بهینه‌سازی فرایندهای تخمیر نیمه‌پیوسته. 13
3- فرایند. 16
3-1- طراحی فرمانتور 17
3-2- كشت نیمه پیوسته (غیر مداوم خوارك‌دهی‌شده) 19
3-2-1- مزایای كشت نیمه پیوسته (غیر مداوم خوارك‌دهی‌شده) 20
3-3- بوتانول(بوتیل الکل) 22
3-3- 1- روش های تولید بوتانول.. 25
3-3-2-1- استفاده از بوتانول به عنوان جایگزین سوخت های فسیلی.. 25
3-3-1-2-تحقیقات انجام شده در زمینه تولید بیولوژیکی بوتانول 27
فصل چهارم. 29
4- مدلسازی.. 30
4-1- مدل بیوراكتور نیمه پیوسته. 30
4-2- مدلهای رشد میكروارگانیسم‌ها 31
4-2-1- مدلهای ساختار نیافته. 31
4-2-1-1- مدلهای مونود، هالدن، كناك، تیسیر و موزر 31
4-2-1-2- مدل شبكه عصبی.. 33
4-2-2- مدلهای ساختاریافته. 33
4-2-2-1- مدلهای مبتنی بر آنالیز موازنه فلاكس (FBA) 35
4-2-2-2- مدلهای مبتنی بر آنالیز موازنه فلاكس پویا (DFBA ) 39
4-3- مدلسازی مورد استفاده در این تحقیق.. 40
4-3-1- معادلات حاكم.. 41
4-4-1- مدل آنالیز موازنه فلاکس پویا برای کشت ناپیوسته گونه طبیعی (وحشی) باکتری کلستریدیوم استوبوتیلیکوم 42
4-4-1-1- تعیین پارامترهای بهینه معادلات جذب مواد غذایی 43
4-4-2- مدل آنالیز موازنه فلاکس پویا برای کشت نیمه پیوسته گونه جهش یافته باکتری کلستریدیوم استوبوتیلیکوم 50
5- بهینه‌سازی.. 59
5-1- استراتژی عملیاتی.. 61
6- نتایج، بحث و نتیجه گیری.. 64
6-1- نتایج حاصل از بهینه سازی.. 64
6-2- مطالعات موضوعی.. 67
6-3- بحث و نتیجه گیری.. 68
منابع.. 70
پیوست یك…. 74
پیوست دو 80
مقدمه‌ای بر بیوتكنولوژی
بی‌تردید زیست‌شناسی جدید با آرایش مبهوت‌كننده‌ای از رشته‌های فرعی گوناگون مثل میكروبشناسی، كالبدشناسی جانوری و گیاهی، زیست شیمی، ایمنی‌شناسی، زیست‌شناسی سلولی، فیزیولوژی گیاهی و جانوری، ریخت‌زایی، سیستماتیك[1]، بوم‌شناسی، دیرینه‌شناسی گیاهی، ژنتیك و بسیاری از رشته‌های دیگر، متنوع‌ترین بخش علوم طبیعی است. تنوع فزاینده زیست‌شناسی جدید بیشتر از آنجا ناشی می‌شود كه پس از جنگ جهانی دوم، رشته‌های علمی دیگر چون فیزیك، شیمی، و ریاضیات در زیست‌شناسی به كار گرفته شد و توصیف فرآیندهای زیستی را در حد سلول و هسته سلولی امكان‌پذیر ساخت.
زیست‌شناسی جدید تاكنون سهم مهمی در رفاه و سلامت بشر داشته است. با این حال آنچه تاكنون از این راه به دست آمده است، در قیاس با نویدهایی كه در سایه بیوتكنولوژی تحقق خواهد یافت بسیار ناچیز است.
بیوتكنولوژی[2] را تحت عنوان «به‌كارگیری ارگانیسم‌ها یا فرایندهای زیستی در صنایع تولیدی و خدماتی» تعریف كرده‌اند. بیوتكنولوژی دانشی است كه كاربرد یكپارچه زیست‌شیمی، میكروبشناسی و تكنولوژی‌های تولید را در سیستم‌های زیستی، به جهت استفاده‌ای كه در سرشت بین رشته‌ای علوم دارند، مطالعه می‌كند.
بیوتكنولوژی صنایع كاملاً نوینی خواهد آفرید كه انرژی فسیلی اندكی لازم دارند و اقتصاد جهانی را تغییر خواهد داد. فرایندهای بیوتكنولوژیك در بیشتر موارد با صرف انرژی كم در دمای پایین انجام می‌شود و در بیوسنتز[3] عمدتاً متكی بر مواد ارزان هستند. فعالیت‌های صنعتی تحت تأثیر آن شامل تولید غذا برای انسان و جانوران، تدارك مواد خام شیمیایی به جای منابع پتروشیمیایی، منابع جایگزین انرژی، به گردش درآوردن پسماندها در طبیعت، كنترل آلودگی، كشاورزی و تولید مواد جدید برای یاری رساندن و متحول كردن بسیاری از جنبه‌های پزشكی، علوم دامپزشكی و دارویی است. بیوتكنولوژی از نظر بین‌المللی همانقدر (چه‌بسا بیشتر) نوید بخش استفاده‌های تجاری است كه انقلاب میكروالكترونیك[4] فراهم كرد. بویژه آنكه صنایع بیوتكنولوژیك عمدتاً بر پایه مواد تجدیدشدنی و گردش‌پذیر خواهد بود و از این‌رو می‌تواند با نیازهای جامعه‌ای كه در آن انرژی روز به روز گران‌تر و كمیابتر می‌شود سازگار شود. بیوتكنولوژی از جهات بسیار هنوز یك تكنولوژی نوپا بوده و پیشرفت‌هایش مستلزم كنترل ماهرانه است، اما توانایی‌های آن گسترده و متنوع است و بی‌تردید در بسیاری از فرآیندهای صنعتی آینده نقش مهم و فزاینده‌ای خواهد داشت.
بیوتكنولوژی ذاتاً حرفه‌ای بین رشته‌ای است. بیوتكنولوژیست[5] فنون مأخوذ از شیمی، میكروبشناسی، مهندسی شیمی و دانش كامپیوتر را به كار می‌گیرد. اهداف اصلی آن، نوآوری، توسعه و اجرای مطلوب فرایندهایی است كه كاتالیزور[6] زیست شیمیایی در آن نقش اصلی و غیر قابل جایگزینی دارد. بیوتكنولوژیست‌ها باید با متخصصین سایر قلمروهای وابسته مانند پزشكی، تغذیه، صنایع شیمیایی و دارویی، حفظ محیط زیست و تكنولوژی به عمل‌آوری مواد پسماند نیز همكاری نزدیك داشته باشند. خاستگاه بسیاری از فرایندهای بیوتكنولوژیك فعلی به تخمیرهای سنتی و باستانی مانند تولید نان، پنیر، ماست و سركه بر می‌گردد. اما كشف آنتی‌بیوتیك‌ها[7] در سال 1929 و سپس تولید انبوه آنها در دهه 1940 بیشترین پیشرفت‌ها را در تكنولوژی تخمیر فراهم آورد. از آن پس ما نه تنها در تولید آنتی‌بیوتیك‌ها، بلكه در تولید بسیاری از فرآورده‌های شیمیایی ساده یا پیچیده مفید، به عنوان مثال اسیدهای آلی، پلی‌ساكاریدها، آنزیم‌ها، واكسن‌ها، هورمون‌ها و غیره شاهد توسعه شگفت‌انگیز تكنولوژی تخمیر بوده‌ایم. علت اصلی توسعه فرایندهای تخمیری رابطه نزدیك و فزاینده بین زیست‌شیمیدان‌ها، میكروب‌شناسان و مهندسان شیمی است.
مهم‌ترین دلیل برای آگاهی روزافزون از بیوتكنولوژی، رسیدن به این واقعیت بود كه منابع سوختهای فسیلی محدود است. بنابراین انسان باید در پی شیوه‌هایی باشد كه با بهره گرفتن از توده زیستی[8]، مستقیم و غیر مستقیم انرژی خورشیدی را به شكل قابل استفاده درآورد. از این توده زیستی بسیاری از مواد شیمیایی ضروری برای بقای انسان به دست خواهد آمد. گرچه صنایع تخمیری سنتی همیشه در بیوتكنولوژی نقش مركزی خواهد داشت، امید بیوتكنولوژیست‌ها امروزه عمدتاً به كاربردهای دو كشف زیست‌شناسی بر می‌گردد كه عبارتند از:
الف) توسعه تكنولوژی یا مهندسی آنزیمی، یعنی استفاده از واحدهای زیستی جداشده با آنزیم‌ها در صنعت و پزشكی.
ب) مهندسی ژنتیكی، یعنی استفاده از توانایی تازه كسب‌شده انسان در انتقال اطلاعات ژنتیكی بین ارگانیسم‌های كاملاً غیر منسوب و دور از هم، مانند گیاهان، جانوران و میكروارگانیسم‌ها.
این قلمروها اساساً در پی بهره‌برداری از كشفیات زیست‌شناسی مولكولی و آنزیمولوژی[9] است و واژه مهندسی مولكول‌های زیستی برای استناد به مجموعه این دو به كار می‌رود.
1-2- بیوتكنولوژی- یك هسته مركزی با دو جزء
در اصل بیوتكنولوژی را می‌توان هسته‌ای مركزی و دارای دو جزء دانست كه در آن یك جزء به دنبال دستیابی به بهترین كاتالیست[10] برای یك فرآیند یا عملكرد ویژه و دیگری با فراهم كردن ساختمان و اجرای فنی در پی ایجاد بهترین محیط ممكن جهت به كار گرفتن كاتالیست است.
در بیشتر مواردی كه تاكنون توسعه یافته است، مؤثرترین، مناسب‌ترین و پایدارترین شكل برای یك كاتالیست در یك فرایند بیوتكنولوژیك ارگانیسم كامل بوده است و به همین دلیل بیشتر كارهای بیوتكنولوژی بر پایه فرآیندهای میكروبی دور می‌زند. این مسئله مانع استفاده از ارگانیسم‌های آلی و بویژه كشت سلول‌های گیاهی و جانوری نیست كه نقش مهم و فزاینده‌ای در بیوتكنولوژی خواهد داشت.
میكروارگانیسم‌ها را می‌توان هم به عنوان نخستین تثبیت‌كنندگان انرژی فتوسنتزی و هم به عنوان سیستم‌هایی در نظر گرفت كه تقریباً در تمام انواع مولكول‌های آلی طبیعی و دست ساخته بشر تغییراتی ایجاد می‌كند. مجموعاً آنها گنجینه ژنی بیكرانی دارند كه پتانسیل تجزیه‌ای و تركیبی (سنتزی) تقریباً نامحدودی فراهم می‌كنند. بعلاوه میكروارگانیسم‌ها در مقایسه با تمام ارگانیسم‌های عالی مانند گیاهان و جانواران میزان رشد بسیار سریعی دارند. پس تحت شرایط محیطی مناسبی در مدت‌زمانی كوتاه می‌توان مقادیر هنگفتی از آنها را تولید كرد.
متدولوژی‌هایی كه عموماً مورد استفاده‌اند، انتخاب میكروارگانیسم‌های بهتر از گنجینه طبیعی محیط، تغییر و تبدیل میكروارگانیسم‌ها توسط جهش و اخیراً بسیج یك رشته از روش‌ها و فنون جدی مأخوذ از زیست‌شناسی مولكولی را فراهم ساخته است كه نهایتاً بازسازی میكروارگانیسم‌هایی با توانایی‌های شیمیایی كاملاً نوین را توسط انسان امكان‌پذیر می‌سازد. این فنون جدید از تلاش‌های بنیادی و اساساً علمی محض در زیست‌شناسی مولكولی طی سالهای اخیر مایه گرفته است. این ارگانیسم‌ها كه بدقت انتخاب و دستكاری شده‌اند باید به شكلی اساساً تغییرناپذیر حفظ شوند كه این كار مستلزم طیف دیگری از فنون برای حفظ ارگانیسم‌ها به منظور ابقای خصوصیات اصلی‌شان طی فرایندهای صنعتی و بالاتر از همه حفظ قدرت و قابلیت زیست آنهاست. در بسیاری از موارد كاتالیست به شكلی جدا و خالص‌شده، یعنی آنزیم به كار گرفته می‌شود و امروزه اطلاعات بسیار زیادی در رابطه با تولید انبوه، جداسازی و خالص كردن تك‌تك آنزیم‌ها و تثبیت آنها به روش‌های مصنوعی در دست است.
دومین بخش هسته مركزی بیوتكنولوژی شامل تمام جنبه‌های سیستم یا راكتوری است كه كاتالیست‌ها در آن عمل می‌كنند. در اینجا دانش ویژه‌ای از مهندسی تولید یا شیمی به كار می‌آید كه طرح و ابزار لازم برای بقا و كنترل محیط فیزیكو- شیمیایی مانند دما، هوادهی، pH و غیره را فراهم می‌كند و بدین ترتیب تجلی بهینه كاتالیست را امكان‌پذیر می‌سازد.
پس می‌بینیم كه موفقیت در یك طرح بیوتكنولوژیك به كاربرد وسیع چندین نظام نیاز دارد.
لازم به ذكر است كه مواد خام حاوی قند، مانند چغندر قند، نیشكر و غلات سودمندترین و در دسترس‌ترین مواد خام برای فرآورده‌های بیوتكنولوژی هستند و گذر زمان نشان خواهد داد كه مواد لیگنوسلولزی[11]، مفیدترین منبع كربن برای پیشرفت بیوتكنولوژیك است ( فرازمند، 1371).
1-3- مقدمه‌ای بر فرآیندهای تخمیری
عبارت تخمیر[12] از واژه لاتین فرور[13] به معنی جوشان گرفته شده است. این اصطلاح بیان‌كننده نقشی است كه مخمر با كشت بر روی موادی مانند عصاره میوه یا جو جوانه زده (مالت) ایفا می‌كند. گازهای جوشان در این واكنش همان حباب‌های دی‌اكسید كربن هستند كه بر اثر فعل و انفعالات میكروارگانیسم‌های بی‌هوازی بر روی قندهای موجود (سوخت و ساز بی‌هوازی مواد غذایی در بافت‌ها) در عصاره متصاعد می‌شوند. از نظر زیست‌شیمی‌دانان و میكرب‌شناسان صنعتی، تخمیر مفهوم متفاوتی دارد. از نظر زیست‌شیمی‌دانان، تخمیر تولید انرژی توسط سوخت‌وساز تركیبات آلی است، در حالی كه از نظر میكرب‌شناسان صنعتی، مفهوم وسیع‌تری را شامل می‌شود. سوخت‌وساز بی‌هوازی قندها، نوعی فرایند اكسایش است كه به تولید نوكلئوتیدهای پیریدین احیا شده منجر می‌شود كه برای ادمه فرایند باید مجدداً اكسید شوند. در فاز اسیدی، اكسایش مجدد نوكلئوتید پیریدین احیا شده، با انتقال الكترون از طریق سیستم سیتوكرم[14] به عنوان دریافت‌كننده نهایی الكترون صورت می‌گیرد. اما در شرایط بی‌هوازی، اكسایش نوكلئوتیدپیریدین احیاشده، با احیای یك تركیب آلی همراه است كه اغلب محصول بعدی در سلسله واكنش‌های سوخت‌وساز به شمار می‌رود. در واكنش مخمر بر روی عصاره میوه و جو، NADH همراه با احیای اسیدپیرویك به اتانل حاصل می‌شود. گونه‌های مختلف میكروارگانیسم‌ها می‌توانند پیروات را به طیف وسیعی از محصولات نهایی احیا كنند. بنابراین از نظر زیست‌شیمی‌دانان «تخمیر نوعی فرآیند تولید انرژی است كه در آن مواد آلی به عنوان دریافت‌كننده نهایی و همچنین دهنده الكترون عمل می‌كنند».
میكرب‌شناسان صنعتی به هر فرآیندی كه برای تولید محصولات مورد نظر از طریق كشت انبوه میكروارگانیسم‌ها یا با بهره گرفتن از میكروارگانیسم‌ها در مقیاس صنعتی بكار گرفته شود، تخمیر می‌گویند. نخستین فرآیند صنعتی تولید فرآورده‌های تخمیری یعنی اتانل از این جمله است. در فرآیندهای تخمیر صنعتی عموماً از باكتری‌ها، مخمر‌ها و قارچ‌ها برای تولید فرآورده‌های زیستی استفاده می‌شود. اخیراً با توسعه فنون كشت سلول، استفاده از سلول‌های حیوانی و گیاهی در فرآیندهای تخمیری امكان‌پذیر شده است.
میكروارگانیسم‌های مورد استفاده در فرآیندهای بیوتكنولوژیك در اصل از محیط طبیعی جدا شده‌اند، اما برای سودمندی بیشتر به دنبال جداسازی توسط متخصصین ژنتیك صنعتی[15] به شكل ارگانیسم‌های برتر تغییر داده شده‌اند. موفقیت در انتخاب و بهبود برنامه‌ها در تمام صنایع مبتنی بر فرآیندهای زیستی (مثلاً تولید آنتی‌بیوتیك‌ها) نتیجه مستقیم همكاری بین تكنولوژیست‌ها و ژنتیك‌دانهاست. برای فرمولبندی خصوصیات فیزیولوژیك و زیست شیمیایی ویژه‌ای كه جهت دستیابی به كامل‌ترین گستره فعالیت‌های بیوتكنولوژیك در ارگانیسم‌های جدید جستجو می‌شود، این همكاری ضروری‌تر خواهد بود. در اصل تمام خواص ارگانیسم‌ها به مجموع ژن‌های آنها بستگی دارد. ژن‌ها در دو دسته اصلی ساختاری و تنظیمی قرار می‌گیرند. ژن‌های ساختاری رمزگزار توالی اسیدهای امینه پروتئین‌ها هستند؛ پروتئین‌ها به عنوان آنزیم، با كاتالیز واكنش‌های سنتزی یا تجزیه‌ای توانایی‌های زیست‌شیمیایی ارگانیسم را تعیین می‌كنند و یا به عنوان اجزای ساختاری سلول‌ها نقش ساختمانی دارند. برعكس، ژن‌های تنظیمی با تعیین میزان تولید فرآورده‌های پروتئینی و در واكنش به علائم درون و بیرون سلولی كه این فرآورده‌ها در پاسخ بدانها تولید می‌شوند، تجلی ژن‌های ساختاری را كنترل می‌كنند.
مهندسی ژنتیكی بی‌تردید یكی از مهم‌ترین قلمروهای پیشرفت بیوتكنولوژی بوده است و برای تولید مواد شیمیایی ساده و پیچیده فرآیندهای آماده‌ای دارد كه انجام آنها را از راه دستكاری میكروب‌ها قبلاً غیر عملی می‌پنداشتند. نمونه این فرآیندها شامل سنتز پروتئین‌های جانوری ویژه، مانند انسولین، افزایش دامنه تولید آنزیم‌ها، هورمون‌ها، تركیبات ضد توموری و ضد ویروسی (اینترفرون)، مواد شیمیایی كوچك و بزرگی چون اتانول و یا ایجاد توانایی در به‌كارگیری مواد پیچیده‌ای چون سلولز و لیگنین برای تولید فرآورده‌های ارزشمند از آنهاست.
مهندسی ژنتیكی پتانسیل توسعه دامنه و قدرت هر جنبه‌ای از بیوتكنولوژی را داراست. نخست آنكه این روش‌ها به شكلی گسترده در بهبود فرایندهای میكروبی موجود به كار خواهند رفت؛ به عنوان مثال، بهبود یافتن پایداری كشت‌های موجود و حذف فرآورده‌های فرعی ناخواسته موجب افزایش بازده فرآورده‌های تخمیری خواهد شد. این اطمینان وجود دارد كه در همین دهه روش‌های نوتركیبی DNA زمینه تولید میكروارگانیسم‌های جدیدی را با خواص متابولیسمی جدید و غیر معمول فراهم خواهد ساخت. بدین ترتیب فرآیندهای تخمیری مبتنی بر این پیشرفت‌های فنی در تولید طیف كاملی از تركیبات شیمیایی، به عنوان مثال اتیلین گلیكول[16] (به عنوان ضد یخ)، اكسید اتیلن[17] (مورد استفاده در پلی‌استرها[18] و مواد فعال کننده سطحی[19]) و پروپیلن گلیكول (مورد استفاده در صنعت پلاستیك‌ها) با صنایع پتروشیمی رقابت خواهد كرد. در صنایع غذایی، سویه‌های بهبودیافته باكتری‌ها و قارچ‌ها بزودی با تأثیرگذاری بر فرآیندهای سنتی، مانند نانوایی و پنیرسازی، موجب كنترل بیشتر و بازآفرینی طعم و بافت آنها خواهد شد (شجاع الساداتی، 1381).
تعداد صفحه :103
قیمت :14700 تومان
