دانشگاه شیراز
دانشکده علوم
پایان نامه کارشناسی ارشد در رشته زیست شناسی (علوم سلولی و مولکولی)
تولید و بررسی خصوصیات بیوشیمیایی آلفا آمیلاز باسیلوس لیکنیفورمیس 1390 BR
استاد راهنما
دکتر حمیدرضا کربلایی حیدری
اسفند ماه 92
(در فایل دانلودی نام نویسنده موجود است)
تکه هایی از متن پایان نامه به عنوان نمونه :
(ممکن است هنگام انتقال از فایل اصلی به داخل سایت بعضی متون به هم بریزد یا بعضی نمادها و اشکال درج نشود ولی در فایل دانلودی همه چیز مرتب و کامل است)
چکیده
بهینه سازی تولید و بررسی خصوصیات بیوشیمیایی آلفا آمیلاز باسیلوس لیکنیفورمیس 1390BR
در پژوهش حاضر ترشح و بررسی خصوصیات آلفا آمیلاز خارج سلولی از باکتری بومی باسیلوس لیکنیفورمیس 1390BR مد نظر بود. سویه 1390BR در محیط حاوی عصاره مخمر 5/0%، پپتون 5/0% و کلرید سدیم 5/0% و آب شهر 5% در دمای ˚C30 و 7~pH کشت داده شد و پس از گذشت مدت زمان 24 ساعت، توسط نشاسته 1/0 % القا گردید. نتایج بیشترین میزان ترشح را 18 ساعت پس از القا نشان داد. آنزیم توسط روش رسوبدهی با استن (v/v)70% و ستون کروماتوگرافی تعویض یونیDEAE-Cellulose تا حد امکان تخلیص گردید. خصوصیات بیوشیمیایی آنزیم تخلیص شده در حضور 5/0% نشاسته نشان داد pH و دمای بهینه آنزیم به ترتیب 0/6 و ˚C 70 میباشد و در دمای ˚C 85 پس از گذشت یک ساعت کمتر از 25% فعالیت خود را از دست میدهد. این آنزیم در محدوده وسیعی از pH (5-12) بیش از 60% فعالیت خود را حفظ می کند. پارامترهای سینتیکی Vmax و Km آلفا آمیلاز سویه 1390BR به ترتیب برابر µM/s 42/0 و mg/ml 02/1 محاسبه شد. فعالیت آنزیم در حضور یونهای Mn2+ و Ca2+ بمدت یک ساعت به میزان 105 و 107% افزایش مییابد و در حضورFe3+ بطور کامل مهار گردید. فعالیت آمیلولیتیک آنزیم در حضور mM5EDTA سبب کاسته شدن تنها 27% از فعالیت اولیه آنزیم گردید. پایداری آنزیم در محدوده وسیع دما و pH و عدم وابستگی شدید فعالیت آنزیم به حضور یون Ca2+ در محیط، این آنزیم را یک کاندید مناسب برای جایگزینی بعضی از آمیلازهای صنعتی امروزی می نماید.
کلمات کلیدی: آلفا آمیلاز، باسیلوس لیکنیفورمیس، پایداری دمایی، صنعت نشاسته
فهرست مطالب
عنوان صفحه
فصل اول.. 1
(مقدمه) 1
1- مقدمه. 2
1-1- آنزیمها 2
1-2- منابع بیوکاتالیزوری.. 2
1-2-1- کاربردهای صنعتی بیوکاتالیزورها 4
1-3- نشاسته. 5
1-4- آمیلازها 6
1-4-1- منابع آلفا آمیلازها 7
1-4-1-1- آمیلازهای باکتریایی.. 7
1-4-1-2- آمیلازهای قارچی.. 7
1-4-2- طبقه بندی آمیلازها 8
آنزیمهای هیدرولیز کننده نشاسته به چهار گروه عمومی تقسیم میشوند: 8
الف) اندو آمیلازها 8
ب) اگزو آمیلازها 8
ج) آنزیمهای شاخه شکن.. 8
د) تراسفرازها 8
1-4-2-1- اندو آمیلازها 8
1-4-2-2- اگزو آمیلازها 9
1-4-2-3- آنزیمهای شاخه شکن.. 9
1-4-3- ساختار آمیلازها 11
1-4-4- مکانیسم عمل آلفا-آمیلاز. 13
1-4-5- کاربردهای آلفا-آمیلازها 14
1-4-5-1- تولید اتانل زیستی.. 15
1-4-5-2- صنایع شوینده. 16
1-4-5-3- صنایع نساجی.. 16
1-4-5-4- کاغذ سازی.. 17
1-4-5-5- صنایع غذایی.. 17
1-5-4-6- تولید نان و شیرینی پزی.. 17
1-4-5-7- تولید شربت گلوکز و فروکتوز. 18
فصل دوم. 20
2- بر پژوهش های پیشین.. 21
فصل سوم. 25
3- ابزار، مواد و روشهای تحقیق.. 26
3-1- ابزار. 27
3-2- مواد. 28
3-2-1- بافرها 28
3-2-2- مواد شیمیایی.. 28
3-2-3- محیطهای کشت مورد نیاز. 28
3-1-4-کشت باکتری مولد آلفا آمیلاز و تشخیص کیفی تولید آنزیم خارج سلولی.. 30
3-2- بررسی سینتیک رشد و فعالیت آلفا آمیلازی باکتری در محیط کشت پایه. 30
3-3- روش های استفاده شده در مراحل سنجش و تخلیص آلفا آمیلاز. 31
3-3-1- تخلیص آنزیم آلفا آمیلاز. 31
3-3-2- تخلیص بر روی ستون DEAE-Cellulose. 31
3-3-3- سنجش فعالیت آنزیمی.. 32
3-3-3-1-روش سنجش فعالیت آنزیم.. 33
3-3-3-2-واحد آنزیمی.. 33
3-3-4- سنجش پروتئین.. 34
3-3-4-1- سنجش کمی پروتئین به روش برادفورد. 34
3-4- روش های بررسی خصوصیات بیوشیمیایی آلفا آمیلاز با خلوص نسبی.. 35
) 35
3-4-2- اثر دما بر فعالیت آلفا آمیلاز با خلوص نسبی.. 37
3-4-3- اثر pH بر فعالیت آلفا آمیلاز. 37
3-4-4- بررسی پایداری حرارتی آنزیم دارای خلوص نسبی.. 37
3-4-5- اثر pH بر پایداری آنزیم دارای خلوص نسبی.. 37
3-4-6- روش بررسی اثر یونهای فلزی و EDTA بر فعالیت آنزیمی.. 38
4- نتایج.. 40
سویه 1390BR.. 40
4-2- سینتیک رشد و تولید آنزیم آلفا آمیلاز. 41
1390BR.. 42
4-4- خصوصیات بیوشیمیایی آلفا آمیلاز. 43
4-4-1- اثر pH و دما بر فعالیت آلفا امیلاز. 43
4-4-2- اثر دما بر پایداری آلفا آمیلاز سویه 1390 BR.. 44
4-4-3- اثر pH بر پایداری آنزیم آلفا آمیلاز. 45
) 46
4-7- اثر یونهای فلزی بر فعالیت آنزیم.. 47
5- بحث و نتیجه گیری.. 50
پیشنهادات.. 54
فهرست جدولها
عنوان صفحه
جدول 1- 1. کاربردهای مختلف آنزیمها. 4
جدول 1-3) ترکیبات بافر Mix. 28
جدول 3-2) نام و اجزاء محیط کشتهای مورد استفاده. 29
جدول 3-2) اجزاء محیط کشت جامد. 29
جدول 3-3. موادلازم در تهیه محلول برادفورد. 35
جدول 4-1) اثر یونهای فلزی بر فعالیت آنزیم. 48
فهرست شکلها
عنوان صفحه
شکل 1-1) منابع تجاری آنزیمها. 3
شکل 1-2) گرانول نشاسته در گیاهان مختلف (الف: نشاسته سیب زمینی شیرین، ب: نشاسته سیب زمینی، ج: نشاسته گندم، د: نشاسته ذرت و هـ: نشاسته برنج) 5
شکل 1-3) ساختار آمیلوز (الف) و آمیلوپکتین(ب). 6
شکل 1-4) انواع آمیلازها و عملکرد و محصول آنها. 10
12
شکل 1-6) یونهای کلسیم در ساختار آلفا آمیلاز. 13
شکل 4-1) کلنی باکتری 1390BR در محیط نشاسته- آگار. هاله تشکیل شده اطراف کلنیها نشان دهنده فعالیت آلفا آمیلازی میباشد. 40
فهرست نمودارها
عنوان صفحه
نمودار 3-1) منحنی استاندارد غلظتهای مختلف D-مالتوز در طول موج nm 540.. 34
نمودار 4-1) رشد باکتری 1390BR.. 41
نمودار 4-2) تولید آنزیم برحسب زمان پس از القا نشاسته 1/0%. 41
نمودار 4-3) کروماتوگرام ستون DEAE Cellulose. 42
نمودار 4-4( اثر pH بر فعالیت آلفا آمیلاز در دمای ˚C 70. فعالیت نسبی به عنوان درصدی از حداکثر فعالیت دیده شده در0/6 ~pH میباشد که 100% در نظر گرفته شده است. 43
نمودار 4-5( اثر دما بر فعالیت آنزیم در0/ 7~pH. فعالیت نسبی به عنوان درصدی از حداکثر فعالیت دیده شده در دمای ˚C 70 میباشد که 100% در نظر گرفته شده است. 44
نمودار 4-6) پایداری فعالیت آنزیمی در دماهای مختلف در طی زمان.. 45
نمودار 4-7) پایداری آلفا آمیلاز در pH مختلف پس از یک ساعت انکوباسیون.. 45
نمودار 4-8) نمودار میکائیلیس- منتن 46
نمودار 4-9) نمودار هانس- ولف… 47
مقدمه
1-1- آنزیمها
آنزیمها، پروتئینهای کروی و مسئول بسیاری از واکنشهای ضروری بیوشیمیایی در میکروارگانیسمها، گیاهان و جانوران هستند. آنزیمها نقشهای مختلفی ایفا می کنند و بدون اینکه خودشان تغییر یابند، توانایی منحصر به فردی در تسـهیل و تسـریع واکنش شیمیایی دارند (Mojsov et al., 2012).
در سیستم طبقه بندی بین المللی آنزیمها[1] براساس عملکرد به شش دسته تقسیم میشوند:
EC1: اکسیدوردوکتازها؛ کاتالیز واکنشهای اکسیداسیون- احیا
EC2: ترانسفرازها؛ کاتالیز انتقال گروه های عاملی
EC3: هیدرولازها؛ کاتالیز آبکافت پیوندها
EC4: لیازها؛ افزودن گروه ها به پیوند دوگانه یا ایجاد پیوندهای دوگانه با برداشت گروه
EC5: ایزومرازها؛ کاتالیز ایزومریزاسیون درون یک ملکول
EC6: لیگازها؛ کاتالیز اتصال کووالان دو ملکول همراه با تجزیهATP .
[1] Enzyme commission
تعداد صفحه : 78
قیمت 70 هزار تومان
70,000 تومانافزودن به سبد خرید