دانلود پایان نامه بررسی شاخص­های پیری و ردیابی ژن آلفامانوزیداز مرتبط با پیری در چند رقم گیلاس

دانشکده تولید گیاهی

 پایان‌نامه جهت اخذ درجه کارشناسی‌ارشد در رشته

مهندسی کشاورزی (علوم باغبانی) – میوه­کاری

بررسی شاخص­های پیری و ردیابی ژن آلفامانوزیداز مرتبط با پیری در چند رقم گیلاس

استاد راهنما:

دکتر مهدی شریفانی

اساتید مشاور:

دكتر فریال وارسته اکبرپور

دکتر سعید نواب­پور

(در فایل دانلودی نام نویسنده موجود است)

تکه هایی از متن پایان نامه به عنوان نمونه :

(ممکن است هنگام انتقال از فایل اصلی به داخل سایت بعضی متون به هم بریزد یا بعضی نمادها و اشکال درج نشود ولی در فایل دانلودی همه چیز مرتب و کامل است)

چکیده

این کار تحقیقی در دو بخش بیوشیمیایی و بیوتکنولوژی در محل آزمایشگاه علوم باغبانی دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان انجام شد. در بخش بیوشیمیایی، جهت بررسی تاثیر کاربرد پس از برداشت اسید آبسیزیک بر شاخص­های کیفی و روند پیری دو رقم زودرس و دیررس گیلاس، آزمایشی فاکتوریل در قالب طرح بلوک­های کامل تصادفی و در چهار تکرار صورت گرفت. تیمار اول، رقم (کرج و تکدانه) و تیمار دوم، اسید آبسیزیک (در دو غلظت صفر و ppm200) مورد بررسی قرار گرفتند. میوه­ها در فواصل زمانی پنج روز و طی مدت 20 روز از زمان برداشت، از لحاظ تغییرات صفات کیفی ارزیابی شدند. طبق نتایج بدست آمده، با گذشت زمان، سفتی در هر دو رقم کاهش یافته، و در نمونه­های تیمار شده با اسید آبسیزیک کاهش بیشتری نشان داد. میزان آنتوسیانین روند افزایشی داشت. میزان کلروفیل کل و کاروتنوئید دم میوه­ها با گذشت زمان به طور معنی­داری کاهش یافت. مواد جامد محلول میوه­ها تا روز دهم کاهش و در روز پانزدهم افزایش پیدا کرد. اسیدیته میوه­ها روند نزولی داشت و در روز بیستم اختلاف معنی­داری بین نمونه­های تیمار شده و تیمار نشده مشاهده شد. با گذشت زمان در میزان قند کل میوه­ها تغییر معنی­داری مشاهده نشد اما به طور کلی تغییرات قند کل دارای روند افزایشی بود. روند تغییرات فروکتوز برای نمونه­های تیمار شده و تیمار نشده با اسید آبسیزیک، در رقم کرج معنی­دار نبود اما بین رقم تکدانه تیمار شده و تیمار نشده با اسید آبسیزیک اختلاف معنی­داری در روز 15 و 20 مشاهده گردید. با توجه به این نتایج، می­توان نقش اسید آبسیزیک را در ایجاد تغییرات کیفی و همچنین تاثیر بر روند پیری میوه­ها، مورد توجه قرار داد. در بخش بیوتکنولوژی، ژن آلفامانوزیداز (یک ژن مرتبط با پیری) برای اولین بار، در پنج رقم مختلف گیلاس شناسایی و تعیین توالی شد. به این منظور، آغازگرهای رفت و برگشت ژن مورد نظر از طریق مراجعه به پایگاه داده NCBI و استفاده از توالی­های مربوط به ژن آلفامانوزیداز برای هلو و فلفل، با بهره گرفتن از کپی کامل cDNA هلو و فلفل طراحی شد. به علت زیاد بودن طول ژن سه جفت آغازگر طراحی شد گه این آغازگرها قادرند طول 3100 جفت­باز را پوشش دهند. همچنین دمای اتصال آغازگرها با بهره گرفتن از برنامه گرادیانت PCR بدست آمد. بعد از استخراج DNA ارقام گیلاس، یک قسمت از ژن مذکور تکثیر، توالی­یابی (با بهره گرفتن از نرم­افزار سنگر) و همردیف­سازی توالی­ها انجام شد و نمودار دندروگرام مربوط به آن با بهره گرفتن از نرم‌افزار 3 View رسم گردید. بررسی و مقایسه توالی­های معکوس، شباهت و تفاوت­هایی را در ارقام مختلف نشان داد که بر طبق آن ارقام پیش­رس (ER)، پیش­رس خارجی (FE) و دیررس (LR) دارای شباهت بیشتر بوده و در یک گروه قرار گرفتند. ارقام پیش­رس قزوین (GH) و دوم­رس (MR) دارای تفاوت بیشتری نسبت به سه رقم اول بوده و با یکدیگر نیز تفاوت نشان داده و هرکدام به طور جداگانه یک گروه مجزا را تشکیل دادند.این تفاوت­ها می­توانند در عملکرد ژن و در نتیجه رفتار گیاه تاثیرگذار باشند. به عنوان مثال، با مطالعات بیشتر و استفاده از تکنیک­های مهندسی ژنتیک، می­توان علت زمان­های متفاوت رسیدگی و تفاوت در طول عمر انبارمانی موجود در ارقام مختلف گیلاس را در این اختلاف توالی‌ها جستجو نمود.

واژه­های کلیدی: گیلاس، اسید آبسیزیک، پیری، آلفامانوزیداز

فهرست مطالب

عنوان                                                                                                               صفحه

1- مقدمه و كلیات………………………………………………………………………………………………………………….. 2

1-1- مقدمه…………………………………………………………………………………………………………………….. 2

1-2- اهداف…………………………………………………………………………………………………………………… 3

1-3- فرضیه ­ها………………………………………………………………………………………………………………… 4

2- سابقه تحقیق…………………………………………………………………………………………………… 6

2-1- خاستگاه و گیاهشناسی گیلاس………………………………………………………………………………… 6

2-2- طبقه ­بندی ارقام گیلاس……………………………………………………………………………………………. 7

2-3- کیفیت میوه…………………………………………………………………………………………………………….. 7

2-3-1- آنتوسیانین……………………………………………………………………………………………………. 7

2-3-2- اسیدیته………………………………………………………………………………………………………… 8

2-3-3- مواد جامد محلول………………………………………………………………………………………….. 8

2-3-4- سفتی بافت…………………………………………………………………………………………………… 9

2-3-5- کلروفیل و کاروتنوئید…………………………………………………………………………………….. 9

2-3-6- کربوهیدرات­ها……………………………………………………………………………………………. 10

2-4- بلوغ و رسیدگی در گیلاس……………………………………………………………………………………. 10

2-5- انبارمانی گیلاس…………………………………………………………………………………………………… 11

2-6- فیزیولوژی تنفس…………………………………………………………………………………………………… 12

2-7- اسید آبسیزیک……………………………………………………………………………………………………… 13

2-8- پیری……………………………………………………………………………………………………………………. 14

2-9- کنترل ژنتیکی متابولیسم گیاه…………………………………………………………………………………. 14

2-10- آنزیم آلفامانوزیداز و نقش آن در رسیدگی…………………………………………………………….. 15

فهرست مطالب

عنوان                                                                                                               صفحه

3- مواد و روش کار…………………………………………………………………………………………………………….. 18

3-1- زمان و مکان آزمایش…………………………………………………………………………………………….. 18

3-2- بخش بیوشیمیایی…………………………………………………………………………………………………. 18

3-2-1- مواد گیاهی…………………………………………………………………………………………………. 18

3-2-2- طرح آماری آزمایش…………………………………………………………………………………….. 18

3-2-3- اندازه ­گیری سفتی……………………………………………………………………………………….. 19

3-2-5- اندازه ­گیری آنتوسیانین………………………………………………………………………………… 19

3-2-6- اندازه ­گیری کلروفیل دم میوه………………………………………………………………………… 19

3-2-7- اندازه ­گیری مواد جامد محلول میوه……………………………………………………………….. 21

3-2-8- اندازه ­گیری اسیدیته قابل تیتراسیون میوه……………………………………………………….. 21

3-2-9- اندازه ­گیری قند…………………………………………………………………………………………… 21

3-2-9-1- مواد مورد نیاز…………………………………………………………………………………… 21

3-2-9-2- استخراج قند…………………………………………………………………………………….. 22

3-2-9-3- اندازه ­گیری قند کل……………………………………………………………………………. 22

3-2-9-4- منحنی استاندارد قند کل……………………………………………………………………. 23

3-2-9-5- اندازه ­گیری فروکتوز………………………………………………………………………….. 23

3-2-9-6- تهیه نمودار استاندارد فروکتوز……………………………………………………………. 24

3-3- بخش بیوتکنولوژی……………………………………………………………………………………………….. 25

3-3-1- مواد گیاهی…………………………………………………………………………………………………. 25

3-3-2- استخراج DNA…………………………………………………………………………………………. 25

3-3-3- طراحی آغازگرها………………………………………………………………………………………… 26

3-3-4- تکثیر قطعات انتخابی………………………………………………………………………………….. 27

فهرست مطالب

عنوان                                                                                                              صفحه

3-3-5- ارزیابی محصول PCR به وسیله تکنیک الکتروفورز ژل آگارز…………………………. 28

3-3-6- توالی­یابی محصول PCR……………………………………………………………………………… 28

3-4- تجزیه و تحلیل آماری……………………………………………………………………………………………. 28

4- نتایج و بحث………………………………………………………………………………………………………………….. 30

4-1- تاثیر کاربرد پس از برداشت اسید آبسیزیک بر سفتی میوه گیلاس…………………………….. 30

4-2- تاثیر کاربرد پس از برداشت اسید آبسیزیک بر تغییرات آنتوسیانین میوه گیلاس…………. 33

4-3- تاثیر کاربرد پس از برداشت اسید آبسیزیک بر کلروفیل کل و کاروتنوئید دم میوه گیلاس 36

4-4- تاثیر کاربرد پس از برداشت اسید آبسیزیک بر میزان مواد جامد محلول میوه گیلاس…… 42

4-5- تاثیر کاربرد پس از برداشت اسید آبسیزیک بر میزان اسیدیته قابل تیتراسیون میوه گیلاس 45

4-6- تاثیر کاربرد پس از برداشت اسید آبسیزیک بر میزان قند کل و فروکتوز میوه گیلاس….. 48

4-7- استخراج DNA…………………………………………………………………………………………………… 53

4-8- نتایج حاصل از طراحی آغازگر………………………………………………………………………………. 54

4-9- تکثیر ژن آلفامانوزیداز در پنج رقم گیلاس………………………………………………………………. 54

4-10- بررسی نتایج حاصل از توالی­یابی و همردیف­سازی توالی­های بدست آمده……………….. 56

4-11- روابط فیلوژنی توالی­های مورد بررسی………………………………………………………………….. 60

4-12- نتیجه ­گیری کلی………………………………………………………………………………………………….. 61

4-3- پیشنهادات…………………………………………………………………………………………………………. 62

فهرست منابع……………………………………………………………………………………………………. 64

مقدمه و كلیات

1-1- مقدمه

از دیرباز پدیده­ عمر یکی از مسائل مهم حیات بوده است. از این­رو افزایش عمر برای موجودات گیاهی، جانوری و یا انسان می ­تواند حائز اهمیت باشد.

پیری در گیاهان به عنوان مرحله­ی نهایی نمو تعریف شده است. از مشخصه­های بارز پیری کنترل روند تغییرات بسیار منظم و کنترل شده فعل و انفعالات فیزیولوژیکی است. از جمله مهمترین این رخدادها توقف فتوسنتز، تجزیه کلروپلاست، کاهش چشمگیر کلروفیل و شکستن پروتئین­ها و لیپید­ها و سایر مولکول­های بزرگ می­باشد (نواب پور و همکاران، 2003).

در میوه­های فرازگرا اتیلن عامل اصلی پیر شدن میوه می­باشد و کنترل اتیلن از مکانیسم­های اصلی جلوگیری از پیری در این میوه­ها است. اما گیلاس یک میوه­ی نافراز­گرا است. این میوه دارای ارقام متفاوتی از نظر طول عمر می­باشد که شناسایی عوامل دخیل در تعیین طول عمر در ارقام زودرس و دیررس می ­تواند منجر به افزایش طول عمر گیلاس گردد.

طی رسیدن میوه، دسته­ای از فرآیندهای بیوشیمیایی که از لحاظ ژنتیکی در گیاه برنامه ­ریزی شده ­اند رخ می­دهد که باعث تغییر ویژگی­های میوه‌ی نارس و تبدیل آن به میوه‌ی رسیده می‌شود (برامل، 2006). همچنین بعد از برداشت محصولات، تغییرات مختلف ساختاری ادامه می­یابند که در جهت تخریب بافت میوه عمل می­ کنند (یو و همکاران، 2003). نرم شدن بیش از حد میوه­ها مساله­ای است که عمر پس از برداشت آنها را کاهش می­دهد. در محصولات تراریخته با تغییر در بیان ژن پروتئین­ها و آنزیم­هایی که بر ویژگی­های دیواره­ی سلولی تاثیرگذار هستند، می­توان میزان فعالیت و تاثیر آنزیم­هایی مثل پلی گالاکتوروناز را در روند رسیدگی و نرم شدن محصول بررسی کرد (برامل و هارپستر، 2001 و واکابایاشی، 2000).

نرم شدن و تغییرات بافتی طی رسیدن میوه­ها در هر گونه­ی خاص، ویژگی­های مخصوص به خود را داراست (برامل و همکاران، 2004). علاوه بر این، تحقیقات نشان داده است که آنزیم­های آلفامانوزیداز (α-Man) و بتادی ان استیل هگزوسامینیداز (ß -Hex) در رسیدگی و نرم شدن میوه­های نافراز­گرا نقش دارند (قوش و همکاران، 2010).

با توجه به نافراز­گرا بودن میوه­ی گیلاس، مشخص نیست که بین ارقام زود­رس و دیر­رس این میوه چه بخشی از ژن­های α-Man و ß-Hex و ژن توسعه­ی سلولی (EXP) باعث تفاوت در طول عمر انباری گیلاس­های زود­رس و دیر­رس می­گردد. همچنین مشخص نمی­باشد که شاخص­های پیری بین دو رقم زود­رس و دیر­رس چه تفاوتی از نظر فعالیت­های آنزیمی α-Man و ß -Hex، لیپاز، پروتئاز و همچنین مقادیر قند، مواد جامد محلول، نشاسته، ساکارز سینتئاز و اینورتاز در طی دوران رسیدگی و پیری دارند. تفاوت الگوی ژنی این آنزیم­ها در سطح ژنومیک نیز مشخص نیست.

در این پژوهش، توالی­ یک ژن­ نامزد عامل پیر شدن به نام آلفامانوزیداز از پایگاه اطلاعاتی ژنوم هلو و فلفل استخراج گشت. بر اساس توالی به دست آمده و کاربرد نرم افزار پرایمر3، توالی پرایمرهای اختصاصی مناسب برای تکثیر این ژن نامزد، طراحی و سپس ساخته شد و ژن­ مربوطه از DNA ژنومیک گیلاس استخراج و به کمک دستگاه ترموسایکلر و روش زنجیره­ای پلیمراز تکثیر و سپس به کمک دستگاه توالی­یاب تعیین توالی شد. در مرحله­ی بعد با کاربرد نرم­افزار پاپ ژن، توالی به­دست آمده برای ژن­ استخراج شده و ارقام زود­رس و دیر­رس مورد مقایسه قرار گرفت و اختلافات موجود از نظر حذف تک نقطه­ای و یا قطعه­ای و یا اضافه شدن ارزیابی شد. در این تحقیق اثر اسید آبسیزیک نیز بر شاخص­های پیری مورد بررسی قرار گرفت.

1-2- اهداف

1. تشخیص تفاوت­های توالی ژن­ مذکور (α-Man) بین دو رقم زود­رس و دیررس و تشخیص هرگونه تفاوت در توالی هر تک نوکلئوتید یا موتاسیون تک نقطه­ای و مقایسه­ این ژن­ها بین ارقام گیلاس زود­رس با انبارداری پایین و دیر­رس با انبارداری بالا
2. مقایسه­ شاخص­های پیری بین این دو رقم گیلاس زود­رس و دیر­رس
3. تعیین تغییرات گلوکز، فروکتوز در زمان رسیدگی و پیری و طیف تغییرات آنها در میوه گیلاس

1-3- فرضیه ­ها

1. ارقام گیلاسی که دیر­رس و دارای طول عمر انبار­داری زیادتر هستند، دارای تفاوت در توالی ژن­ مربوطه می­باشند که این احتمالا مربوط به منطقه دومین آنزیم می­باشد.
2. کاربرد هورمون اسید آبسیزیک در ارقام دیر­رس باعث بروز پیری با تاخیر بیشتری نسبت به ارقام زود­رس می­گردد.

 2- سابقه تحقیق

گیلاس[1] یکی از محصولات مهم و جذاب باغبانی در دنیا می­باشد. در کشور ما نیز این محصول به دلیل طعم و مزه مطلوب و دوره رسیدگی کوتاه میوه و تولید در اوایل فصل از اهمیت بالایی برخوردار است. با توجه به افزایش سطح زیر کشت و تولید باغ­های تجارتی و از طرفی گسترش آفات و بیماری­ها، افزایش هزینه نیروی کار در مناطق تولیدکننده جهان، قابلیت فساد سریع میوه و سیستم‌های ضعیف برای حمل و نقل که مانع توسعه چشمگیر این محصول تا 100 سال گذشته شده بود، نیاز به استفاده از فن­آوری­های پیشرفته در مراحل مختلف تولید و نگهداری این محصول بیشتر اهمیت می‌یابد. به همین علت، در تمامی مناطق تولیدکننده گیلاس اهداف مهم بهنژادی این محصول در قالب برنامه‌های کوتاه­مدت و درازمدت به جدیت پیگیری می‌شود (گنجی­مقدم و بوذری، 1388).

2-1- خاستگاه و گیاهشناسی گیلاس

بر اساس اطلاعات بدست آمده از حفاری­های باستان­شناسی و هسته­ها ونقوش بجامانده مشخص شده است که نیاکان قبل از تاریخ از میوه­های این درخت استفاده می­نمودند. اولین شواهد استفاده از گیلاس به عنوان یک منبع غذایی به 4000 تا 5000 سال قبل از میلاد مسیح برمی­گردد و یونانی­ها اولین کسانی بودند که به صورت اهلی به کشت و کار این میوه اقدام نمودند.

منشاء این درخت، غرب آسیا، شمال چین، افغانستان، ترکیه و ایران (اطراف دریای خزر) است. بهنژادی کنترل شده این درخت از قرن هجدهم آغاز گردید و تا قبل از آن فقط توسط گزینش تصادفی و طبیعی این عمل صورت گرفته است.

اکثر گیاهشناسان گیلاس­ها را در جنس پرونوس[2] و تیره رزاسه[3] تقسیم­بندی می­نمایند. این گیاه جزء گیاهان گلدار و نهاندانه می­باشد. اکثر آنها دیپلوئید (16= n2) بوده، اگرچه ارقام تریپلوئید و تتراپلوئید هم در آنها مشاهده شده است. این درخت جزء میوه­های هسته­دار، خزان­کننده و بزرگ قامت است. گیلاس دارای گل­های کامل، دوجنسی و گل­آذین آن به صورت دیهیم می­باشد. رنگ گل‌ها سفید و به صورت منفرد یا گروهی حداکثر پنج تا هفت تایی در روی شاخه­های یکساله و یا اسپور تشکیل می­شوند. میوه گیلاس ساده، گوشتی و شفت است که درون­بر میوه سخت و چوبی شده است و پوشش دانه غشایی و نازک است. سطح هسته صاف و میوه آن دارای یک هسته است (گنجی مقدم و بوذری، 1388).

2-2- طبقه ­بندی ارقام گیلاس

بیشتر سیستم­های طبقه بندی کنونی ارقام گیلاس را بر اساس رنگ پوست، محکمی گوشت، رنگ آب میوه و زمان رسیدگی آنها طبقه ­بندی می­ کنند. اساس این طبقه ­بندی­ها بیشتر خصوصیات و ذائقه مختلف مردم جهان می­باشد.

به طور کلی از نقطه نظر پرورش­دهندگان گیلاس، مهم­ترین خصوصیت گیلاس­ها علاوه بر میزان محصول، زمان رسیدگی، اندازه میوه، رنگ پوست، زمان گلدهی و سازگاری با ارقام دیگر، مقاومت به ترک­خوردگی، محکمی گوشت میوه و قابلیت نگهداری میوه در طول مراحل برداشت تا فروش می‌باشد (وبستر و همکاران، 1996).

2-3- کیفیت میوه

کیفیت میوه یکی از اهداف مهم اصلاحی گیلاس است. شاخص­های کیفیت می ­تواند مربوط به عوامل داخلی یا ظاهری میوه باشد. اهمیت معیارهای خارجی به طور کلی ممکن است از نظر مصرف کنندگان بیشتر باشد ولی در صورتی که آنها از کیفیت داخلی میوه مطمئن نباشند در خرید محصول کاهش چشمگیری رخ می­دهد. صفاتی که به طور عمومی جهت اندازه ­گیری کیفیت در میوه­های گیلاس و برنامه ­های انتخاب رقم استفاده می­شوند عبارتند از: رنگ سطحی میوه، رنگ گوشت، اندازه و شکل میوه، نسبت مواد جامد محلول به اسیدیته، سفتی بافت، میزان چسبندگی میوه به دم و مزه میوه. جهت اندازه‌گیری صفات کیفی، رسیدگی همزمان میوه لازم می‌باشد (گنجی­مقدم و بوذری، 1388).

2-3-1- آنتوسیانین

آنتوسیانین­ها به گروه بزرگی از ترکیبات که به فلاونوئیدها معروف­اند تعلق دارند و از پر رنگ­ترین آن­ها می­باشند (هاپکینز، 1999). این ترکیبات رنگدانه­های محلول در آب هستند و اغلب در شیره واکوئل یافت می­شوند و مسئول رنگ­های قرمز، صورتی، آبی و بنفش در بسیاری از میوه­ها و سبزی­ها هستند (هاپکینز، 1999؛ دموند و جان، 2000). ساختمان گلیکوزیدها از یک قند با یک ترکیب حلقوی به نام سیانیدین ساخته می­شود (مایر و همکاران، 1973). جزء قندی آنتوسیانین­ها را اغلب گلوکز، رامنوز، گالاکتوز، گزیلوز و آرابینوز تشکیل می­ دهند (سحری، 1381).

تعداد صفحه : 90

قیمت :14700 تومان

بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد

و در ضمن فایل خریداری شده به ایمیل شما ارسال می شود.

پشتیبانی سایت :        *       [email protected]

در صورتی که مشکلی با پرداخت آنلاین دارید می توانید مبلغ مورد نظر برای هر فایل را کارت به کارت کرده و فایل درخواستی و اطلاعات واریز را به ایمیل ما ارسال کنید تا فایل را از طریق ایمیل دریافت کنید.