پایان نامه استفاده ازماده ترت بوتیل هیدروپراکساید t-BHPیک مدل حیوانی از استرس اکسیداتیو به منظور مطالعه اثر آن در چگونگی بیان ژن (Kdm5d)Smcy

متن کامل پایان نامه مقطع کارشناسی ارشد رشته :زیست شناسی

عنوان : استفاده ازماده ترت بوتیل هیدروپراکساید  t-BHPیک مدل حیوانی از استرس اکسیداتیو به منظور مطالعه اثر آن در چگونگی بیان ژن (Kdm5d)Smcy

(در فایل دانلودی نام نویسنده موجود است)

تکه هایی از متن پایان نامه به عنوان نمونه :

(ممکن است هنگام انتقال از فایل اصلی به داخل سایت بعضی متون به هم بریزد یا بعضی نمادها و اشکال درج نشود ولی در فایل دانلودی همه چیز مرتب و کامل است)

فهرست مطالب

عنوان                                   صفحه

چکیده. ج‌

مقدمه. 2

فصل اول کلیات

1- ناباروری.. 4

1-1- علل ناباروری در مردان.. 4

1-2- رادیکال‌های آزاد. 5

1-2-1- تعریف و نحوه تشکیل رادیکال‌‌های آزاد. 5

1-2-2- نحوه عملکرد رادیکال‌های آزاد. 5

1-2-3- گونه­ های فعال اکسیژن و نیتروژن.. 5

1-2-3-1- نقش­های بیولوژیک ROS.. 6

1-2-4- تولید و منبع رادیکال­های آزاد. 6

1-2-4-1- تولید ROS توسط اسپرماتوزوآی غیر طبیعی.. 7

1-2-4-2- تولید ROS توسط لکوسیت­ها 7

1-2-5- استرس اکسیداتیو. 8

1-2-5-1- مکانیسم عملکرد استرس اکسیداتیو. 8

1-2-5- اثرات استرس اکسیداتیو. 9

1-2-5-1- استرس اکسیداتیو و آسیب به DNA… 9

1-2-6-1-2- اهمیت سلامت DNA اسپرم. 11

1-2-6-2-استرس اکسیداتیو در اسپرم. 12

1-2-6-3- استرس اکسیداتیو و بیماری­های دیگر. 12

1-2-7- اثراتROS.. 13

1-2-7-1- پراکسیداسیون لیپیدی غشای پلاسمایی اسپرم. 13

1-2-7-2- اثر روی تحرک اسپرم. 13

1-2-8-  ROS و استرس اکسیداتیو مایع منی.. 13

1-2-9-  ROS و ناباروری.. 14

1-2-10- آنتی اکسیدان­ها 15

1-2-10-1- نحوه عملکرد آنتی­اکسیدان­ها به دو روش طبقه بندی میشود: 16

1-2-11- اثرات آنتی­اکسیدان­ها 18

1-2-11-1- تاثیر بر تحرک اسپرم. 18

1-2-11-2- تاثیر بر روی کاهش آسیب­های بعد از انجماد اسپرم. 18

1-2-11-3- تاثیر آنتی­اکسیدان­ها در جلوگیری از آسیب بهDNA… 18

1-2-12- نقش آنتی­اکسیدان­ها (رباینده­های­بالقوهROS) دراسپرم. 19

3-1- ژنتیک و ناباروری مردان.. 20

1-3-1- ژن انتخابی مورد مطالعه. 21

1-4- اهداف: 22

1-5-فرضیات: 22

فصل دوم مروری بر مطالعات گذشته

2-1-  مروری بر مطالعات علمی گذشته. 24

فصل سوم مواد و روش­ها

3-1- تعیین گروه­ های آزمایشی.. 30

3-2- جمع آوری نمونه­ ها و محل انجام آزمایش…. 30

3-3- القاء استرس اکسیداتیو با تزریق t-BHP.. 31

3-4-  تک سلول کردن بافت بیضه. 31

3-5- شمارش تعداد سلول­های زنده در بافت بیضه. 32

3-6-1- روش فلوسایتومتری.. 32

3-6-2-  سنجش ROS در بیضه بوسیله فلوسایتومتری.. 34

3-7- روش های تعیین آسیب DNA اسپرم. 35

3-7-1- تست TUNEL جهت ارزیابی شکست  DNAاسپرم. 36

3-7-2- جمع‌ آوری سلول‌های اسپرمی جهت آنالیز شکستهای DNA اسپرم. 37

3-7-3-  محلولها و بافرهای مورد نیاز جهت روش TUNEL، به منظور ارزیابی شکست DNA اسپرم. 39

3-7-4- مراحل انجام آزمایش TUNEL.. 39

3-7-5- نحوه استفاده از کیت TUNEL.. 40

3-8-  بررسی بیان ژن Kdm5d یا Smcy. 40

3-8-1- استخراج RNA به روش ترایزول.. 41

3-8-2- بررسی کیفی RNAهای استخراج شده به وسیله الکتروفورز روی ژل آگارز 42

3-8-3- تیمار کردن نمونه­ های RNAی استخراج شده 43

3-8-4-  سنتزDNA  مکمل (cDNA) از روی الگوی RNA… 44

3-8-5- روش انجام واکنش زنجیرهای پلی مراز (PCR) جهت اطمینان از سنتز cDNA… 46

3-8-6-روش تهیه­ ژل آگارز و انجام الکتروفورز 48

3-8-7- طرز تهیه­ محلول­ها 48

1- بافر50x TAE.. 48

2- محلول رنگ آمیزی اتیدیوم برماید (10mg/ml) 48

3-8-8- بررسی کمی بیان ژن با بهره گرفتن از روش واکنش زنجیرهای پلیمرازپیوسته. 49

3-8-8-1-روش C_t مقایس­های برای کمی سازی نسبی.. 50

3-8-6- آنالیز آماری.. 52

فصل چهارم نتایج

4-1-  بررسی وزن بدن و بافت بیضه پس از 14 روز تزریق.. 54

4-2- بررسی ماکروسکوپی بافت بیضه. 55

4-3- بررسی میزان ROS در بیضه­ی گروه کنترل و آزمون.. 56

4-3-1- اندازه گیری میزان O₂ و H₂O₂ 56

4-4-  نتایج ارزیابی شکست DNA اسپرم با تست TUNEL.. 59

4-5- بررسی وضعیت بیانی ژن Kdm5d در بافت بیضه. 61

4-5-1- استخراج RNA کل از بافت بیضه. 61

4-5-2- بررسی صحت سنتز cDNA… 62

4-5-3- بررسی بیان کمی ژن Kdm5d در بافت بیضه. 63

فصل پنجم بحث و نتیجه ­گیری 

5-1- بحث و نتیجه گیری کلی.. 67

5-2- پیشنهادات: 70

منابع.. 71

خلاصه انگلیسی… 80

ضمائم.. 81

فهرست جداول

عنوان                                                                              صفحه

جدول 1-1: انواع آنتی­اکسیدان­ها و مکانیسم عملکرد آنها 17

جدول 3-1: ترکیب محیط TCM…. 38

جدول 3-2: ترکیب محیط 38

جدول 3-3: ژن مورد نظر و توالی پرایمر مورد استفاده 40

جدول 3-4: مواد مورد استفاده در تیمار نمونه­ هایRNA… 43

جدول 3-5: مواد مورد استفاده در سنتزcDNA… 45

جدول 3-6: برنامه دمایی سنتز cDNA… 45

جدول 3-7: مواد مورد استفاده در RT-PCR… 47

جدول 3-8: برنامه دمایی RT-PCR و تعداد سیکل­های هر مرحله. 47

جدول 3-9: اجزای لازم برای انجام واكنش  Real-Time PCR… 51

جدول 3-10: برنامه دمایی Real-Time PCR… 51

جدول 4-1: میانگین وزن بدن در طول تزریق و بافت بیضه پس از 14 روز تزریق.. 54

جدول 4-2: میزان درصد H2O2 و O2 موجود در دو گروه کنترل و آزمون در نمونه­ های بیضه­ای با بهره گرفتن از تکنیک فلوسایتومتری.. 58

جدول 4-3: درصد شکست DNA اسپرم با روش TUNEL در گروه کنترل و آزمون.. 60

جدول 4-4: داده ­های گزارش شده برای آنالیز کمی ژن Kdm5d.. 64

جدول 4-5: آنالیز نتایج  Real-Time PCR با بهره گرفتن از نرم افزار REST.. 64

فهرست اشکال

عنوان                                                                                                                                   صفحه

شکل 1-1: ارتباط بین  ATMو P53 در پاسخ­های ترمیم DNA یا آپوپتوز حاصل از آسیب ایجاد شده توسط استرس اکسیداتیو. 9

شکل 1-2: ارتباط بین افزایش تولید ROS با ناباروری.. 15

شکل 1-3: فشردگی کروماتین قبل از ورود به میوز توسط کمپلکس Smcy-MSH5.. 21

شکل 3-1: شمایی از لام نئوبار 32

شکل 3-2: DCFH-DA و مکانیسم عمل آن.. 34

شکل 3-3: روش­های ارزیابی شکست DNA و نحوه تشخیص آن­ها 36

شکل3-4: اساس روش TUNEL.. 37

شکل 4-1: نمونه­ های بافت بیضه در موش­های کنترل و آزمون.. 56

شکل 4-2: ارزیابی آسیب DNA در نمونه آزمون با روش TUNEL با بهره گرفتن از میکروسکوپ فلورسنت(1000×) 60

شکل 4-3: نمونه RNA­های استخراج شده از بافت بیضه. 62

شکل 4-4: محصولات RT-PCR. 63

شکل 4-5: منحنی تفکیک ژن مربوطه. 65

فهرست نمودار

عنوان                                                                                                                                   صفحه

نمودار 4-1: مقایسه وزن بدن و بافت بیضه میان گروه کنترل و آزمون. 55

نمودار 4-2: نمودار هیستوگرام از سلول­های بیضه­ای در یکی از نمونه­ های گروه کنترل و آزمون.. 57

نمودار 4-3: نتیجه حاصل از بررسی میزان ROS (H2O₂ و ̊O₂) در نمونه­ های بیضه بین دو گروه کنترل و آزمون  59

نمودار 4-4: نتیجه حاصل از بررسی میزان شکست DNA در نمونه­ های اسپرم بین دو گروه کنترل و آزمون  61

نمودار 4-5: نمودار بیان نسبی ژنKdm5d. 65

چکیده

ناباروری عمده­ترین مشکل تولیدمثلی است که حدود 15درصد زوج های جوان در جهان را درگیر می­ کند. این عارضه دلایل مختلفی دارد که فاکتورهای مردانه مسؤول 40 درصد این دلایل می­باشند. در بررسی دلایل ناباروری مردان، استرس اکسیداتیو و فاکتورهای ژنتیکی نقش اساسی ایفا می کنند. گونه های اکسیژن فعال (ROS) می­توانند سبب افزایش استرس اکسیداتیوشوند. افزایش استرس اکسیداتیو می ­تواند موجب اثرات مخربی بر روی عملکرد سیستم تولید مثل از جمله شکست DNA اسپرم و تغییر بیان ژن­های دخیل در اسپرماتوژنز شود.

در این تحقیق با بهره گرفتن ازماده ترت بوتیل هیدروپراکساید  t-BHPیک مدل حیوانی از استرس اکسیداتیو به منظور مطالعه اثر آن در چگونگی بیان ژن Kdm5d(Smcy) ایجاد گردید. این ژن در مرحله لپتوتن/زیگوتن میوز به کمک فاکتور ترمیمی MSH5سبب دمتیله شدن هیستون 3 لیزین 4 (H3K4) شده و در فشرده شدن کروماتین نقش مهمی داشت.پس از تعیین دوز  LD₅₀برای  t-BHP، به میزان یک دهم آن به مدت 14 روز به موش­های نر بالغ Balb/c به صورت داخل صفاقی تزریق شد. سپس میزان ROS در بیضه بوسیله فلوسایتومتری اندازه ­گیری و میزان شکست DNA اسپرم با روش TUNEL سنجیده و بیان ژن Kdm5d  مورد ارزیابی قرار گرفت.

فلوسایتومتری افزایش استرس اکسیداتیو در موش­های گروه تیماری نسبت به گروه کنترل را نشان داد.  همچنین میزان شکست DNAدر موش­های گروه تیماری نسبت به گروه کنترل با آزمایش تانل به اثبات رسید. بیان ژن Kdm5d در گروه آزمون از طریق Real time PCR نشان داده شد. کاهش بیان ژن Kdm5d را می­توان به آسیب­های وارد شده به DNA و سایر مکانیزم­ ها از جمله تغییرات اپی­ژنتیکی که می­توانند در بیان ژن­ها تاثیرگذار باشند، نسبت داد.

کلمات کلیدی: ناباروری مردان، استرس اکسیداتیو، ژنKdm5d

مقدمه :

ناباروری عمده­ترین مشکل مربوط به سلامت سیستم تولیدمثل در جهان است که حدود 15درصد زوج­های جوان را درگیر می­ کند. حدود 40% از ناباروری­ها مربوط به فاکتورهای مردانه است. این عارضه دلایل مختلفی از جمله واریکوسل، عفونت، ضایعات انسدادی، سیستیک فیبروزیس، تومورها و علت­های جدید همانند استرس اکسیداتیو دارد. استرس اکسیداتیو(OS) [1]در نتیجه عدم تعادل بین گونه­ های اکسیژن فعال (ROS)[2]و آنتی اکسیدان­ها در بدن می­باشد که می ­تواند از طریق اختلال در فرایند اسپرماتوژنز، عملکرد و ساختار اسپرم(بد­شکلی اسپرم، واکنش آکروزومی، آسیب به  DNAو عدم لقاح) منجر به ناباروری مردان شود. رادیکال­های آزاد و پراکسیدها ازمتابولیسم اکسیژن در تمام سلول­های هوازی سبب افزایش اکسیدان­ها در بدن می­شوند و می‌توانند با اكسایش تركیبات درون سلولی، به عملکرد و بقاء سلول­ها از جمله اسپرم­ها‌ آسیب برسانند. از عواملی که به­عنوان سد دفاعی سلول، در برابر استرس اکسیداتیو عمل می­ کنند آنتی­اکسیدان­ها هستند که به­ صورت آنزیمی و غیر آنزیمی در سلول­های اسپرم و مایع منی وجود دارند. هدف از این مطالعه بررسی تاثیر استرس اکسیداتیو بر بیان ژن Kdm5d است.

فصل اول

کلیات

1- ناباروری

ناباروری[3]  یکی از مشکلات بالینی می­باشد که به دلیل شیوع و اهمیت آن، محققان روی این موضوع متمرکز شده ­اند(Comhaire, 1987). ناباروری در یک زوج بطورکلی به عنوان عدم توانایی برای بارداری بعد از یک سال مقاربت بدون جلوگیری تعریف می­ شود که حدود 15% از زوجین را در گیر می­سازد که 40% این ناباروری­ها مربوط به فاکتورهای مردانه می­باشد(Gnoth et al., 2005; Sharlip et al., 2002). ناباروری در مردان بوسیله آنالیز مایع منی[4] قابل تشخیص است. طبیعی بودن اسپرموگرام[5] – تست تشخیصی که غلظت، تحرک و ریخت­شناسی اسپرم­ها را اندازه ­گیری می­ کند –  عدم حضور سایر اختلالات را ثابت نمی­ کند(Poongothai, Gopenath, & Manonayaki, 2009). شواهد نشان می­ دهند که آسیب­های وارده به اسپرم بواسطه گونه­ های فعال اکسیژن (ROS) یکی از دلایل مهم ناباروری در 30-80 درصد موارد ناباروری مردان محسوب می­شوند(Agarwal, Prabakaran, & Allamaneni, 2006).

1-1-علل ناباروری در مردان

علل ناباروری در مردان را می­توان به چند گروه تقسیم کرد:

• اختلال در تعداد و عملکرد اسپرم که این گروه از مردان دارای اسپرم­گرام غیر طبیعی هستند.
• ضایعات انسدادی که بیشتر مجاری دیستال را تحت تاثیر قرار می­دهد مانند آزواسپرمیای انسدادی که ناشی از عوامل ژنتیکی از جمله فیبروز سیستیک است که موجب عدم مادرزادی مجرای وازدفران شود.
• اختلال در اسپرماتوژنز در نتیجه ضایعه­ در بافت بیضه در اثر ضربه به بیضه، عفونت شدید مجاری تناسلی، اشعه ایکس و شیمی درمانی است.
• اختلالات اندوکرین که مربوط به غدد درون ریز از جمله هایپوگنادیسم می­باشد(Esteves, Miyaoka, & Agarwal, 2011; Wiser, Sandlow, & Köhler, 2012).
• از جمله عوامل دیگر با وجود آنالیز طبیعی مایع منی، سابقه نرمال، معاینه فیزیکی و همینطور رد ناباروری با فاکتور زنانه می­توان به حضور آنتی بادی­های ضد اسپرم، آسیب DNA اسپرم و سطح بالایی از گونه­ های فعال اکسیژن اشاره کرد(Cummins, Jequier, & Kan, 1994).

تعداد صفحه : 90

قیمت :14700 تومان

بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد

و در ضمن فایل خریداری شده به ایمیل شما ارسال می شود.

پشتیبانی سایت :        *       parsavahedi.t@gmail.com

در صورتی که مشکلی با پرداخت آنلاین دارید می توانید مبلغ مورد نظر برای هر فایل را کارت به کارت کرده و فایل درخواستی و اطلاعات واریز را به ایمیل ما ارسال کنید تا فایل را از طریق ایمیل دریافت کنید.

 

14,700 تومانافزودن به سبد خرید

—-

پشتیبانی سایت :       

*         parsavahedi.t@gmail.com