(در فایل دانلودی نام نویسنده موجود است)
تکه هایی از متن پایان نامه به عنوان نمونه :
(ممکن است هنگام انتقال از فایل اصلی به داخل سایت بعضی متون به هم بریزد یا بعضی نمادها و اشکال درج نشود ولی در فایل دانلودی همه چیز مرتب و کامل است)
فهرست مطالب
عنوان صفحه
1-1- علل ناباروری در مردان.. 4
1-2-1- تعریف و نحوه تشکیل رادیکالهای آزاد. 5
1-2-2- نحوه عملکرد رادیکالهای آزاد. 5
1-2-3- گونههای فعال اکسیژن و نیتروژن.. 5
1-2-3-1- نقشهای بیولوژیک ROS.. 6
1-2-4- تولید و منبع رادیکالهای آزاد. 6
1-2-4-1- تولید ROS توسط اسپرماتوزوآی غیر طبیعی.. 7
1-2-4-2- تولید ROS توسط لکوسیتها 7
1-2-5-1- مکانیسم عملکرد استرس اکسیداتیو. 8
1-2-5- اثرات استرس اکسیداتیو. 9
1-2-5-1- استرس اکسیداتیو و آسیب به DNA… 9
1-2-6-1-2- اهمیت سلامت DNA اسپرم. 11
1-2-6-2-استرس اکسیداتیو در اسپرم. 12
1-2-6-3- استرس اکسیداتیو و بیماریهای دیگر. 12
1-2-7-1- پراکسیداسیون لیپیدی غشای پلاسمایی اسپرم. 13
1-2-7-2- اثر روی تحرک اسپرم. 13
1-2-8- ROS و استرس اکسیداتیو مایع منی.. 13
1-2-10-1- نحوه عملکرد آنتیاکسیدانها به دو روش طبقه بندی میشود: 16
1-2-11- اثرات آنتیاکسیدانها 18
1-2-11-1- تاثیر بر تحرک اسپرم. 18
1-2-11-2- تاثیر بر روی کاهش آسیبهای بعد از انجماد اسپرم. 18
1-2-11-3- تاثیر آنتیاکسیدانها در جلوگیری از آسیب بهDNA… 18
1-2-12- نقش آنتیاکسیدانها (ربایندههایبالقوهROS) دراسپرم. 19
3-1- ژنتیک و ناباروری مردان.. 20
1-3-1- ژن انتخابی مورد مطالعه. 21
فصل دوم مروری بر مطالعات گذشته
2-1- مروری بر مطالعات علمی گذشته. 24
3-1- تعیین گروههای آزمایشی.. 30
3-2- جمع آوری نمونهها و محل انجام آزمایش…. 30
3-3- القاء استرس اکسیداتیو با تزریق t-BHP.. 31
3-4- تک سلول کردن بافت بیضه. 31
3-5- شمارش تعداد سلولهای زنده در بافت بیضه. 32
3-6-2- سنجش ROS در بیضه بوسیله فلوسایتومتری.. 34
3-7- روش های تعیین آسیب DNA اسپرم. 35
3-7-1- تست TUNEL جهت ارزیابی شکست DNAاسپرم. 36
3-7-2- جمعآوری سلولهای اسپرمی جهت آنالیز شکستهای DNA اسپرم. 37
3-7-3- محلولها و بافرهای مورد نیاز جهت روش TUNEL، به منظور ارزیابی شکست DNA اسپرم. 39
3-7-4- مراحل انجام آزمایش TUNEL.. 39
3-7-5- نحوه استفاده از کیت TUNEL.. 40
3-8- بررسی بیان ژن Kdm5d یا Smcy. 40
3-8-1- استخراج RNA به روش ترایزول.. 41
3-8-2- بررسی کیفی RNAهای استخراج شده به وسیله الکتروفورز روی ژل آگارز 42
3-8-3- تیمار کردن نمونههای RNAی استخراج شده 43
3-8-4- سنتزDNA مکمل (cDNA) از روی الگوی RNA… 44
3-8-5- روش انجام واکنش زنجیرهای پلی مراز (PCR) جهت اطمینان از سنتز cDNA… 46
3-8-6-روش تهیه ژل آگارز و انجام الکتروفورز 48
2- محلول رنگ آمیزی اتیدیوم برماید (10mg/ml) 48
3-8-8- بررسی کمی بیان ژن با بهره گرفتن از روش واکنش زنجیرهای پلیمرازپیوسته. 49
3-8-8-1-روش Ct مقایسهای برای کمی سازی نسبی.. 50
4-1- بررسی وزن بدن و بافت بیضه پس از 14 روز تزریق.. 54
4-2- بررسی ماکروسکوپی بافت بیضه. 55
4-3- بررسی میزان ROS در بیضهی گروه کنترل و آزمون.. 56
4-3-1- اندازه گیری میزان O2 و H2O2 56
4-4- نتایج ارزیابی شکست DNA اسپرم با تست TUNEL.. 59
4-5- بررسی وضعیت بیانی ژن Kdm5d در بافت بیضه. 61
4-5-1- استخراج RNA کل از بافت بیضه. 61
4-5-2- بررسی صحت سنتز cDNA… 62
4-5-3- بررسی بیان کمی ژن Kdm5d در بافت بیضه. 63
5-1- بحث و نتیجه گیری کلی.. 67
فهرست جداول
عنوان صفحه
جدول 1-1: انواع آنتیاکسیدانها و مکانیسم عملکرد آنها 17
جدول 3-3: ژن مورد نظر و توالی پرایمر مورد استفاده 40
جدول 3-4: مواد مورد استفاده در تیمار نمونههایRNA… 43
جدول 3-5: مواد مورد استفاده در سنتزcDNA… 45
جدول 3-6: برنامه دمایی سنتز cDNA… 45
جدول 3-7: مواد مورد استفاده در RT-PCR… 47
جدول 3-8: برنامه دمایی RT-PCR و تعداد سیکلهای هر مرحله. 47
جدول 3-9: اجزای لازم برای انجام واكنش Real-Time PCR… 51
جدول 3-10: برنامه دمایی Real-Time PCR… 51
جدول 4-1: میانگین وزن بدن در طول تزریق و بافت بیضه پس از 14 روز تزریق.. 54
جدول 4-3: درصد شکست DNA اسپرم با روش TUNEL در گروه کنترل و آزمون.. 60
جدول 4-4: دادههای گزارش شده برای آنالیز کمی ژن Kdm5d.. 64
جدول 4-5: آنالیز نتایج Real-Time PCR با بهره گرفتن از نرم افزار REST.. 64
فهرست اشکال
عنوان صفحه
شکل 1-2: ارتباط بین افزایش تولید ROS با ناباروری.. 15
شکل 1-3: فشردگی کروماتین قبل از ورود به میوز توسط کمپلکس Smcy-MSH5.. 21
شکل 3-1: شمایی از لام نئوبار 32
شکل 3-2: DCFH-DA و مکانیسم عمل آن.. 34
شکل 3-3: روشهای ارزیابی شکست DNA و نحوه تشخیص آنها 36
شکل 4-1: نمونههای بافت بیضه در موشهای کنترل و آزمون.. 56
شکل 4-2: ارزیابی آسیب DNA در نمونه آزمون با روش TUNEL با بهره گرفتن از میکروسکوپ فلورسنت(1000×) 60
شکل 4-3: نمونه RNAهای استخراج شده از بافت بیضه. 62
شکل 4-5: منحنی تفکیک ژن مربوطه. 65
فهرست نمودار
عنوان صفحه
نمودار 4-1: مقایسه وزن بدن و بافت بیضه میان گروه کنترل و آزمون. 55
نمودار 4-2: نمودار هیستوگرام از سلولهای بیضهای در یکی از نمونههای گروه کنترل و آزمون.. 57
نمودار 4-4: نتیجه حاصل از بررسی میزان شکست DNA در نمونههای اسپرم بین دو گروه کنترل و آزمون 61
نمودار 4-5: نمودار بیان نسبی ژنKdm5d. 65
چکیده
ناباروری عمدهترین مشکل تولیدمثلی است که حدود 15درصد زوج های جوان در جهان را درگیر می کند. این عارضه دلایل مختلفی دارد که فاکتورهای مردانه مسؤول 40 درصد این دلایل میباشند. در بررسی دلایل ناباروری مردان، استرس اکسیداتیو و فاکتورهای ژنتیکی نقش اساسی ایفا می کنند. گونه های اکسیژن فعال (ROS) میتوانند سبب افزایش استرس اکسیداتیوشوند. افزایش استرس اکسیداتیو می تواند موجب اثرات مخربی بر روی عملکرد سیستم تولید مثل از جمله شکست DNA اسپرم و تغییر بیان ژنهای دخیل در اسپرماتوژنز شود.
در این تحقیق با بهره گرفتن ازماده ترت بوتیل هیدروپراکساید t-BHPیک مدل حیوانی از استرس اکسیداتیو به منظور مطالعه اثر آن در چگونگی بیان ژن Kdm5d(Smcy) ایجاد گردید. این ژن در مرحله لپتوتن/زیگوتن میوز به کمک فاکتور ترمیمی MSH5سبب دمتیله شدن هیستون 3 لیزین 4 (H3K4) شده و در فشرده شدن کروماتین نقش مهمی داشت.پس از تعیین دوز LD50برای t-BHP، به میزان یک دهم آن به مدت 14 روز به موشهای نر بالغ Balb/c به صورت داخل صفاقی تزریق شد. سپس میزان ROS در بیضه بوسیله فلوسایتومتری اندازه گیری و میزان شکست DNA اسپرم با روش TUNEL سنجیده و بیان ژن Kdm5d مورد ارزیابی قرار گرفت.
فلوسایتومتری افزایش استرس اکسیداتیو در موشهای گروه تیماری نسبت به گروه کنترل را نشان داد. همچنین میزان شکست DNAدر موشهای گروه تیماری نسبت به گروه کنترل با آزمایش تانل به اثبات رسید. بیان ژن Kdm5d در گروه آزمون از طریق Real time PCR نشان داده شد. کاهش بیان ژن Kdm5d را میتوان به آسیبهای وارد شده به DNA و سایر مکانیزمها از جمله تغییرات اپیژنتیکی که میتوانند در بیان ژنها تاثیرگذار باشند، نسبت داد.
کلمات کلیدی: ناباروری مردان، استرس اکسیداتیو، ژنKdm5d
مقدمه :
ناباروری عمدهترین مشکل مربوط به سلامت سیستم تولیدمثل در جهان است که حدود 15درصد زوجهای جوان را درگیر می کند. حدود 40% از ناباروریها مربوط به فاکتورهای مردانه است. این عارضه دلایل مختلفی از جمله واریکوسل، عفونت، ضایعات انسدادی، سیستیک فیبروزیس، تومورها و علتهای جدید همانند استرس اکسیداتیو دارد. استرس اکسیداتیو(OS) [1]در نتیجه عدم تعادل بین گونههای اکسیژن فعال (ROS)[2]و آنتی اکسیدانها در بدن میباشد که می تواند از طریق اختلال در فرایند اسپرماتوژنز، عملکرد و ساختار اسپرم(بدشکلی اسپرم، واکنش آکروزومی، آسیب به DNAو عدم لقاح) منجر به ناباروری مردان شود. رادیکالهای آزاد و پراکسیدها ازمتابولیسم اکسیژن در تمام سلولهای هوازی سبب افزایش اکسیدانها در بدن میشوند و میتوانند با اكسایش تركیبات درون سلولی، به عملکرد و بقاء سلولها از جمله اسپرمها آسیب برسانند. از عواملی که بهعنوان سد دفاعی سلول، در برابر استرس اکسیداتیو عمل می کنند آنتیاکسیدانها هستند که بهصورت آنزیمی و غیر آنزیمی در سلولهای اسپرم و مایع منی وجود دارند. هدف از این مطالعه بررسی تاثیر استرس اکسیداتیو بر بیان ژن Kdm5d است.
فصل اول
کلیات
1- ناباروری
ناباروری[3] یکی از مشکلات بالینی میباشد که به دلیل شیوع و اهمیت آن، محققان روی این موضوع متمرکز شدهاند(Comhaire, 1987). ناباروری در یک زوج بطورکلی به عنوان عدم توانایی برای بارداری بعد از یک سال مقاربت بدون جلوگیری تعریف میشود که حدود 15% از زوجین را در گیر میسازد که 40% این ناباروریها مربوط به فاکتورهای مردانه میباشد(Gnoth et al., 2005; Sharlip et al., 2002). ناباروری در مردان بوسیله آنالیز مایع منی[4] قابل تشخیص است. طبیعی بودن اسپرموگرام[5] – تست تشخیصی که غلظت، تحرک و ریختشناسی اسپرمها را اندازه گیری می کند – عدم حضور سایر اختلالات را ثابت نمی کند(Poongothai, Gopenath, & Manonayaki, 2009). شواهد نشان می دهند که آسیبهای وارده به اسپرم بواسطه گونههای فعال اکسیژن (ROS) یکی از دلایل مهم ناباروری در 30-80 درصد موارد ناباروری مردان محسوب میشوند(Agarwal, Prabakaran, & Allamaneni, 2006).
1-1-علل ناباروری در مردان
علل ناباروری در مردان را میتوان به چند گروه تقسیم کرد:
- اختلال در تعداد و عملکرد اسپرم که این گروه از مردان دارای اسپرمگرام غیر طبیعی هستند.
- ضایعات انسدادی که بیشتر مجاری دیستال را تحت تاثیر قرار میدهد مانند آزواسپرمیای انسدادی که ناشی از عوامل ژنتیکی از جمله فیبروز سیستیک است که موجب عدم مادرزادی مجرای وازدفران شود.
- اختلال در اسپرماتوژنز در نتیجه ضایعه در بافت بیضه در اثر ضربه به بیضه، عفونت شدید مجاری تناسلی، اشعه ایکس و شیمی درمانی است.
- اختلالات اندوکرین که مربوط به غدد درون ریز از جمله هایپوگنادیسم میباشد(Esteves, Miyaoka, & Agarwal, 2011; Wiser, Sandlow, & Köhler, 2012).
- از جمله عوامل دیگر با وجود آنالیز طبیعی مایع منی، سابقه نرمال، معاینه فیزیکی و همینطور رد ناباروری با فاکتور زنانه میتوان به حضور آنتی بادیهای ضد اسپرم، آسیب DNA اسپرم و سطح بالایی از گونههای فعال اکسیژن اشاره کرد(Cummins, Jequier, & Kan, 1994).
تعداد صفحه : 90
قیمت :14700 تومان