دانشگاه آزاد اسلامی
واحد ورامین – پیشوا
پایان نامه کارشناسی ارشد رشته مهندسی کشاورزی – علوم دامی(M.Sc)
گرایش فیزیولوژی
موضوع:
مقایسه اثرات سطوح مختلف لسیتین سویا و زرده تخم مرغ در محیط انجماد بر كیفیت اسپرم قوچ افشاری در داخل فصل تولیدمثل
استاد راهنما:
دکتر حسن صادقی پناه
استاد مشاور:
دکتر کاظم کریمی
سال تحصیلی1393-
برای رعایت حریم خصوصی نام نگارنده پایان نامه درج نمی شود
(در فایل دانلودی نام نویسنده موجود است)
تکه هایی از متن پایان نامه به عنوان نمونه :
(ممکن است هنگام انتقال از فایل اصلی به داخل سایت بعضی متون به هم بریزد یا بعضی نمادها و اشکال درج نشود ولی در فایل دانلودی همه چیز مرتب و کامل است)
فهرست مطالب
عنوان صفحه
چکیده……………………………………………………………………………………………………………………. 1
فصـل اول: کـلیات
1-1- پرورش گوسفند………………………………………………………………………………………………. 3
1-2- حفظ انجماد منی……………………………………………………………………………………………… 3
1-3- هدف آزمایش……………………………………………………………………………………………….. 8
1-4-پرسش اصلی تحقیق (مساله تحقیق)………………………………………………………………………. 9
فصل دوم: پیشینه تحقیق
2-1- حفظ انجمادی………………………………………………………………………………………………… 11
2-1-1- کاربرد و فواید حفظ انجمادی منی………………………………………………………………….. 11
2-1-2- انواع روشهای حفظ انجمادی……………………………………………………………………….. 12
2-1-3- تاریخچه حفظ انجماد منی قوچ …………………………………………………………………….. 12
2-1-4- مراحل حفظ انجمادی منی……………………………………………………………………………. 14
2-2- عوامل موثر بر انجماد اسپرم قوچ…………………………………………………………………………. 15
2-2-1- رقیق کننده ها…………………………………………………………………………………………….. 15
2-2-3- مواد نگهدارنده یا محافظت کنندهها………………………………………………………………….. 16
2-2-3-1- مواد نگهدارنده درون سلولی یا نفود کننده……………………………………………………… 16
2-2-3-2- مواد نگهدارنده برون سلولی یا نفود ناپذیر…………………………………………………….. 18
2-3-آشنایی اختصاری با سیستم آنالیز رایانه ای (CASA)………………………………………………… 27
فصل سوم: مواد و روشها
3-1- تجهیزات مورد نیاز برای جمع آوری، انجماد، ذوب و ذخیره منی و ارزیابیهای اسپرم……… 31
3- 2-آزمایش اول……………………………………………………………………………………………………………………………………… 31
3-3- آزمایش دوم…………………………………………………………………………………………………………………………………….. 31
3-4- حیوانات و جمع آوری منی……………………………………………………………………………………………………………. 32
3-5- آماده سازی رقیق کنندهها………………………………………………………………………………………………………………… 32
3-6- رقیق سازی، انجماد و ذوب منی…………………………………………………………………………………………………… 33
3-7- ارزیابیهای کیفیت اسپرم بعد از فرآیند انجماد-ذوب…………………………………………………………………. 33
3-8- آنالیز آماری………………………………………………………………………………………………………………………………………. 35
فصل چهارم: نتـایج
4-1- نتایج…………………………………………………………………………………………………………….. 38
فصل پنجم: بحث و نتیجه گیری
5-1- بحث……………………………………………………………………………………………………………. 44
5- 2- نتیجه گیری…………………………………………………………………………………………………… 52
5-3- پیشنهادها ……………………………………………………………………………………………………… 54
منابع……………………………………………………………………………………………………………………… 55
فهرست جداول
عنوان صفحه
جدول 3-1-تجهیزات مورد نیاز برای جمع آوری، انجماد، ذوب و ذخیره منی و ارزیابیهای اسپرم…………………….. 31
جدول4-1-2- صفات ارزیابی شده رقیق کننده حاوی سطوح مختلف لسیتین اسپرم قوچ افشاری پس از انجماد .. 38
جدول4-1-3- صفات ارزیابی شده رقیق کننده حاوی سطوح مختلف زرده تخم مرغ اسپرم قوچ افشاری پس از انجماد 39
جدول4-1-4- مقایسه ویژگی های حرکتی(مربوط به CASA) اسپرم قوچ افشاری در بین تیمارهای اختصاص یافته 41
جدول4-1-5- صفات ارزیابی شده رقیق کنندههای حاوی سطوح مختلف لسیتین و زرده تخم مرغ اسپرم قوچ افشاری پس از انجماد ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 42
فهرست نمودارها
عنوان صفحه
نمودار 4-1-1 مقایسه سطوح مختلف لسیستین اسپرم قوچ افشاری پس از انجماد……………………………………………… 39
نمودار 4-1-2 مقایسه سطوح مختلف زرده تخم مرغ اسپرم قوچ افشاری پس از انجماد…………………………………….. 40
چکیده
فرایند انجماد و ذوب اسپرم شامل در معرض قرار گرفتن ابتدایی اسپرم با مواد محافظ انجمادی، کاهشدما به زیرصفر درجه سلسیوس، ذخیره، ذوب و سرانجام حذف ماده محافظ انجمادی و بازگشت به حالت طبیعی است. این تغییرات باعث آسیبهای ساختاری و بیوشیمیایی به اسپرم میشود که می تواند زندهمانی و باروری اسپرم را تحت تاثیرقرار دهد. هدف از این پژوهش، بررسی اثر سطوح مختلف لسیتین(5/0، 1، 5/1 و 2 %) و زرده تخم مرغ(10، 15، 17 و 20 %) در رقیقکننده پایه تریس- فروکتوز (همراه با 5 درصد گلیسرول) پسازفرآیند انجمادو یخگشایی بود. نمونههای منی توسط واژن مصنوعی از 4 راس قوچ افشاری بالغ، هفتهای 2 بار جمعآوری شد. نمونههای منی رقیق شده در معرض بخار ازت منجمد و در تانک حاوی ازت مایع ذخیره شد و سپس یخگشایی پایوتهای حاوی اسپرم در آب گرم 37 درجه سلسیوس انجام شد. تحرککلوتحرک پیشرونده اسپرم با کمک سامانه آنالیز رایانه‌ای اسپرم اندازهگیری شد. سلامت غشا، درصد اسپرمهای زنده و مورفولوژی اسپرمها بعد از فرایند یخگشایی اندازهگیری شد. نتایج حاصل از این آزمایش نشان داد که رقیقکننده حاوی 5/1% لسیتین و 15% زرده تخممرغ در مقایسه با سایر سطوحهای آزمایشی موجب بهبود معنیدار در میزان تحرک کل، تحرک پیشرونده، یکپارچگیغشا و اسپرمهایزنده شد (01/0p < ). سطوح مختلف لسیتین و زرده تخم مرغ اثر معنیداری روی مورفولوژی اسپرمها نداشتند (05/0p > ). مطابق با نتایج این پژوهش به نظر می‌رسد که افزودن 5/1% لسیتین و 15% زرده تخممرغ به رقیقکنندههای انجماد اسپرم قوچ افشاری باعث بهبود معنیدار فراسنجههای اسپرم از جمله تحرک و درصد اسپرمهای زنده میشود.
کلید واژه ها : لسیتین، رقیق کننده، اسپرم منجمد، قوچ افشاری
پرورش گوسفند
پرورش گوسفند در ایران دارای قدمت تاریخی بسیار طولانیمیباشد که هم اکنون ایران با داشتن 55 میلیون راس گوسفند، در رتبه چهارم جهان قرار دارد. اما متاسفانه به علت عدم بازده تولید مثلی و عدم استفاده از تلقیح مصنوعی در صنعت پرورش گوسفند، صرفه اقتصادی خوبی از این صنعت به دست نیامده و رشد چندانی نکرده است. بنابراین این مطالعه در مرحله اول به منظور انجماد منی قوچ با رقیق کنندههای بر پایه منشا گیاهی(لسیتین سویا) و حیوانی(زرده) برای بهبود کیفیت مناسب اسپرم بعد از فرآیند انجماد-ذوب و در مرحله دوم به منظور ارزیابیعملکرد این رقیق کنندهها با تست‌هایآزمایشگاهی مهممرتبط با توان باروری اسپرم صورت گرفت. نتیجه استفاده از این تستها، انتخاب رقیق کننده مناسب برای انجماد منی قوچ برای استفاده در تلقیح مصنوعی و انجام آسان برنامه های اصلاح نژادی و در نهایت گسترش پرورش گوسفند و اقتصادی بودن آن خواهد شد.
1-2- حفظ انجماد منی
حفظ انجماد منی و تلقیح مصنوعی فواید زیادی را برای صنعت پرورش حیوانات اهلی، به ویژه برای بهبود تولید مثلی و ژنتیکیارائه می کنند. اما بزرگترین مانع در حفظ انجماد منی، آسیبی است که به ساختمان اسپرم در طول فرآیند انجماد- ذوب وارد میشود که منجر به باروری ضعیف اسپرم منجمد میگردد (بارباس و همکاران، 2009). در طول سالهای اخیر، ابداع و توسعهی انواع رقیق کنندههای منی جهت انجماد اسپرم و در نتیجه افزایش راندمان و موفقیت تلقیح مصنوعی گسترش زیادی پیدا کرده است. لذا محققین مطالعات گستردهای برای تولید رقیق کنندههایی که بتوانند باعث حفظ انجمادی اسپرم شوند، انجام دادند. از مهمترین مزایای منجمد کردن منی قوچ، میتوان به بارور نمودن همزمان تعداد زیادی میش با بهره گرفتن از اسپرم قوچهای با نژاد برتر و چندقلوزا، انتقالآسان منیاز مراکز تولید و جمعآوری به دورترین دامداریها، انجام زایشخارج از فصل تولید مثلی، جلوگیری از انقراض گونههای در معرض خطر اشاره نمود (سالامون و مکسول، 2000).
در تحقیقات مرتبط با حفظ انجماد منی، بسیاری از مطالعات بر تشخیص آسیبهای وارد شده به اسپرم در طول فرآیند انجماد- ذوب تمرکز نمودهاند(تریمچ و همکاران، 1997: مدیروس و همکاران، 2002). در حالیکه، مطالعات فراوان دیگری نیز به استفاده از محافظت کنندههای مختلف در رقیق کننده منی برای جلوگیری یا کاهش این آسیبها، برای بهبود کیفیت اسپرم بعد از فرآیند انجماد-ذوب تاکید کرده‌اند(تساک ماکدیس، 2010: فیزر و همکاران، 1984 ). بیشتر ارزیابیهای آزمایشگاهی که برای سنجش کیفیت منی استفاده میشود، همبستگی بالایی با توان باروری اسپرم ندارند. استفاده از رنگهای فلورسنت با بهره گرفتن از میکروسکوپ فلورسنت و دستگاه فلوسایتومتری، تجزیهو تحلیل گستردهتری از پارامترهای اسپرم مانند زنده مانی، یکپارچگیغشا و DNA، وضعیت آکروزوم، کروماتینوظرفیتدارشدن، عملکرد میتوکندری و تغییرات ساختاری (آپوپتوزیس) اسپرم را فرآهم نموده است (گراهام، 2001).
در بحث رقیق کننده منی برای جلوگیری بهتر از آسیب انجمادی[1] به کیفیت اسپرم، محافظت کنندههای انجمادی[2] مختلفی برای انجماد اسپرم در چند دهه گذشته استفاده شده است(کری و همکاران، 2000: واتسون، 1976). کیفیت اسپرم پس از ذوب، به دلیل وقوع شوک سرمایی و تنش اسمزی در طی فرآیند انجماد- ذوب کاهش مییابد(سالامون و ویزر، 1972: بیلی و همکاران، 2000). بسیاری از این صدمات را می توان با رقیق کننده مناسب و مواد محافظ انجمادی مانع شد(گیل و همکاران، 200). ترکیبات موجود در رقیق کنندهها باید بتوانند اسپرم را نسبت به شرایط متغیر بوجود آمده حفاظت نموده و حتی الامکان دچار صدمات کمتری کنند(هولت، 1997). غشاهای سلولی در برابر آسیب ناشی از انجماد حساسیت بالایی دارند، به طوریكه طی فرایند سرد شدن تنشی بر غشا اعمال شده که اثرات زیان آوری را به دنبال خواهد داشت. در نتیجهی این تغییر، سلول ممکن است سوراخ شده که منجر به مرگ آن میشود(پاپا و مکاران، 2011). علاوه بر این، این تغییر ممکن است منجر به تجزیه ترکیبات سطحی غشا شود. بنابراین حفظ سلامت غشا برای تولید اسپرم با كیفیت، بعد از انجماد بسیار اهمیت دارد(هولت و همکاران، 1992). رقیق کنندههای منی دارای خواص ویژهای هستند که موجب نگهداری طولانی تر اسپرمها میشوند. این مواد در تأمین انرژی مورد نیاز، حفاظت اسپرم از آسیبهای دمایی، کاهش استرسهای فیزیکی و شیمیایی ناشی از سرد کردن، انجماد-ذوب اسپرمها و در نهایت ایجادیک محیط مناسب برای زنده ماندن موقت اسپرمها نقش دارند(کری، 2000). گلیسرول، دی متیل سولفوکساید و اتیلن گلیکول دارای وزن مولكولی كم بوده و عوامل محافظ انجمادی درون سلولی یا نفوذ کننده هستند و منابع لیپوپروتیینی یا مواد با وزن مولکولی بالا مثل زرده تخم مرغ، شیر یا لسیتین سویا برای جلوگیری از شوک سرمایی و گلوکز یا فروکتوز به عنوان منابع انرژی و سایر افزودنیها مانند آنزیمها و آنتی بیوتیکها به رقیق کننده اضافه میشود(اماموردی و همکاران، 2013). منابع حیوانی مانند زرده تخممرغ، یک جزء طبیعی از رقیق کنندههای منی است که غشای سلول اسپرم را در مقابل شوک سرمایی، در طول انجماد-ذوب محافظت می کند(واتسون، 1981). مکانیسم محافظتی توسط فسفولیپیدها (لسیتین) و لیپوپروتئینهای با چگالی پایین[3] انجام میگیرد(ویدسور و وایت، 1997: موکه و همکاران، 2008). مطالعات قبلی نشان داد که اسپرم قوچ می تواند در برابر شوک سرمایی، با افزودن 15 درصد زرده تخم مرغ به رقیق کننده تریس محافظت شود(فیزر و همکاران، 1984). با این حال، زرده تخم مرغ ممکن است آنتاگونیست مواد محافظ انجمادی، حاوی آلودگیهای میکروبی و خطر انتقال بیماریها، تغییرات زیاد در ترکیبات آنها، دشواری مشاهدات میکروسکوپی و سبب ظرفیت دار شدن اولیه اسپرم باشد. پروتئینهای گیاهی مانند لسیتین سویا[4]، فاقد این ایرادات زرده تخم مرغ میباشند.
در چند سال گذشته رقیقکنندههای جدید حاوی لسیتینسویا برای جایگزینی زرده تخممرغ، به طور گسترده برای انجماد منی استفاده شده است(دل واله و همکاران، 2012: گیل و همکاران، 2003: فوکویی و همکاران، 2007). در نتیجه بهبود حفظ انجماد منی، به تشخیص آسیبهای وارده به کیفیت اسپرم و استفاده از رقیق کننده منی مناسب برای جلوگیری از آسیبهای انجمادی به اسپرم را در طی فرآیند انجماد-ذوب میطلبد.
بنابراین، هدف پژوهش حاضر، بررسی استفاده از سطوح مختلف لسیتین سویا (5/0، 1، 5/1و 2%) و زرده تخم مرغ (10، 15، 17 و20 %) و مقایسه آنها و انتخاب بهترین سطوح آنها برای استفاده در رقیق کننده منی قوچ، ارزیابی اثر آن بر خصوصیات جنبایی، زنده مانی و یکپارچگی غشای اسپرم قوچ در طی انجماد-ذوب میباشد.در طول سالهای اخیر، پژوهشهای بسیاری روی بهبود حفظ انجمادی منی[5] قوچ برای گسترش تلقیح مصنوعی صورت گرفته است. بقا و تحرك اسپرم پس از انجماد–ذوب تحت تاثیر فاکتورهای متعددی از قبیل كیفیت منی، نوع و غلظت اجزای موجود در محیط انجماد منی از قبیل غلظت گلیسرول و یا سایر مواد محافظ کننده مانند منابع پروتئینی و لیپوپروتئینی است. این مواد در تأمین انرژی مورد نیاز، حفاظت اسپرم از آسیبهای دمایی، کاهش استرسهای فیزیکی و شیمیایی ناشی از سرد کردن و انجماد- ذوب اسپرمها و در نهایت ایجاد یک محیط مناسب برای حفظ کیفیت اسپرم نقش دارند. بنابراین استفاده از محیط انجماد مناسب منی قوچ که بتواند از اسپرمها در برابر آسیبهای انجماد- ذوب محافظت کند و بقا و تحرک اسپرم را بعد از انجماد- ذوب حفظ کند، گام مهمی در جهت استفاده از اسپرم منجمد در تلقیح مصنوعی گوسفند و مطالعات آزمایشگاهی است.
فرآیند انجماد اسپرم اکثر پستانداران مستلزم گذراندن دو مرحله میباشد. در مرحله اول که دوره خنک کردن[6] نامیده میشود، دمای منی رقیق شده از دمای 35-30 درجه به 5 درجه سلسیوس و در مرحله دوم که دوره منجمد کردن میباشد، دمای منی رقیق شده از 5 درجه به 196- درجه سلسیوس در نیتروژن مایع کاهش داده میشود. در مرحله اول برای مقابله با شوک سرمایی، رقیق كنندههای سرمایی به منی اضافه میگردد. این رقیق كنندهها معمولا حاوی لسیتین، پروتئینها و لیپوپروتئینهای زرده تخممرغ میباشند. در ابتدای مرحله دوم كه مرحله انجماد است، به منظور حفاظت اسپرم در مقابل صدمات ناشی از تشکیل بلورهای یخ، از رقیق كنندههای انجمادی كه حاوی 7-3 درصد گلیسرول است استفاده میشود که موجب حفظ اسمولاریته شده و ظرفیت بافری رقیق کننده را تامین می کند (دیپاز و همکاران، 2010: ویندسور و وایت، 1995). غشاهای سلولی در برابر آسیب ناشی از انجماد دارای حساسیت بالایی میباشند به طوری كه در طی فرآیند سرد شدن یک استرس حرارتی بر روی غشا ایجاد شده و منجر به تغییر کریستال مایع به فاز ژلی میشود که در نتیجه اثرات زیان آوری را به دنبال خواهد داشت. در نتیجه این تغییر، سلول ممکن است سوراخ شده و منجر به مرگ سلول شود. علاوه بر آن، این تغییر ممکن است منجر به تجزیه ترکیبات سطحی غشا شود (هولت، 1984). بنابراین حفظ سلامت غشا برای تولید اسپرماتوزواهای با كیفیت بعد از انجماد بسیار اهمیت دارد. کشف خصوصیات حفاظتی گلیسرول در حین انجماد اسپرم در سال 1949 میلادی توسط پولژ باعث شد که بتواند برای اولین بار اسپرم حیوانات را منجمد کند. اینکه چگونه گلیسرول باعث حفظ اسپرم در حین انجماد میشود یک پدیده کاملا شناخته شده است، چون هنوز هم در مورد مکانیسم عمل آن اختلاف نظر وجود دارد. گلیسرول قابلیت نفوذ پذیری بالایی داشته و اثر درون سلولی از خود نشان میدهد. برای مثال اثر آبکشی شدید و بالای گلیسرول باعث کاهش تشکیل کریستالهای یخ درون سلولی میشود. مکانیسمی که گلیسرول باعث آبکشی و کاهش دمای انجمادی میشود به پتانسیل بالای پیوند آبی آن مربوط میشود که درنتیجه غلظت الکترولیتهای آزاد شده افزایش یافته و ساخته شدن کریستالهای یخ به تأخیر افتاده و یا مقدار آن کاهش می یابد که در نتیجه اسپرم در مقابل تغییرات فشار اسمزی و غلظتهای نمک محافظت میشود(مکلاگین و همکاران، 1992). علاوه بر گلیسرول، دی متیل سولفوکساید و اتیلنگلایکول هم استفاده میشوند که دارای وزن مولكولی كم هستند و عوامل محافظ انجمادی درون سلولی یا نفوذ کننده[7] نامیده میشوند.
منابع لیپوپروتئینی یا مواد با وزن مولکولی بالا مثل زردهی تخم مرغ، شیر یا لسیتینسویا برای جلوگیری از شوک سرما[8] و گلوکز یا فروکتوز به عنوان منابع انرژی و سایر افزودنیها مانند آنزیمها و آنتی بیوتیکها به رقیق کننده اضافه میشود(بلکشاو، 1995). برای تقویت رقیقكنندهها معمولا از تركیبات با منشا حیوانی نظیر زرده تخممرغ و شیر كامل استفاده میشود. این رقیق کنندهها قادرند احتیاجات مورد نیاز اسپرم را که در بخشهای قبلی ذکرشد، تامین کنند. زرده تخم مرغ نیز یک جزء معمول تشکیل دهنده محیطهای انجماد است و با عمل بر روی غشا سلولی، اسپرم را در برابر شوک سرما محافظت می کند، اما این رقیق کنندهها مشکلاتی نیز با خود دارند به طوریکه درسالهای اخیر بحثهای زیادی را به خود اختصاص دادهاند. یکی ازاین مشكلات، تغییرات زیاد درترکیبات آنهاست به طوریکه استاندارد سازی هر یك از اجزای ویژه و مفید موجود در آن رقیق كننده بر خصوصیات انجمادی اسپرم را با مشکل مواجه می کند. علاوه بر این زرده تخم مرغ و شیر ممکن است حاوی آلودگیهای میکروبی باشند که با تولید سموم، ظرفیت باروری اسپرماتوزوا را شدیدا کاهش داده و حتی باعث از بین رفتن آنها شوند و از همه مهمتر اینکه باعث انتقال بیماریهایی مثل آنفولانزای مرغی شوند. از دیگر مشکلات زردهی تخم مرغ وجود مواد مضر از قبیل پروژسترون است که سبب ظرفیت دار شدن زود هنگام[9] اسپرم در طی انجماد میشود. در محیط دارای زردهیتخم مرغ به علت وجود مواد اضافی، مشاهدات میکروسکوپی اسپرم دشوار است. همچنین مواد موجود در زرده سبب مهار تنفس اسپرمها یا کاهش تحرک آنها میشود و نیز سموم اندوتوکسین تولیدی توسط آلودگیهای موجود در زرده تخممرغ باعث کاهش باروری اسپرم میشود. بنابراین آلودگیهای مایکوپلاسمایی و باکتریایی موجود در منابع حیوانی مورد استفاده در انجماد منی و گسترش منیهای منجمد گونههای مختلف در سطح جهان همواره نگرانی گسترش بیماریهایی مانند جنون گاوی و آنفلوآنزای مرغی را در سطح جهان در پی داشته است(ابوگلا و همکاران، 2004: امیرات و همکاران، 2004). فراوانی منابع گیاهی و عدم وجود آلودگی منابع گیاهی این ضرورت را ایجاد می کند که این منابع جایگزین منابع حیوانی گردد، به طوریکه منابع گیاهی به ویژه لسیتینسویا در مطالعات زیادی برای انجماد اسپرم گونههای مختلف استفاده شده است که در فصل پیشینه تحقیق به طور کامل بررسی شده است.
تعداد صفحه : 73
قیمت :14700 تومان