دانلود متن کامل پایان نامه مقطع کارشناسی ارشد رشته بیوتکنولوژی کشاورزی

عنوان : كلون و بیان فاكتور نكروز دهنده تومور آلفا (TNF-α)

دانشگاه زنجان

پایان نامه جهت دریافت درجه کارشناسی ارشد در رشته بیوتکنولوژی کشاورزی

كلون و بیان فاكتور نكروز دهنده تومور آلفا (TNF-α)

 

اساتید راهنما:

دکتر علی حق نظری – دکتر سیاوش دستمالچی

 

استاد مشاور:

دكتر داود فرج زاده

 

 

مهر 1388

برای رعایت حریم خصوصی نام نگارنده پایان نامه درج نمی شود

(در فایل دانلودی نام نویسنده موجود است)

تکه هایی از متن پایان نامه به عنوان نمونه :

(ممکن است هنگام انتقال از فایل اصلی به داخل سایت بعضی متون به هم بریزد یا بعضی نمادها و اشکال درج نشود ولی در فایل دانلودی همه چیز مرتب و کامل است)

چکیده

 
مقدمه

علایم اختصاری

 
فصل اول: بررسی منابع  
1-1- بیوتکنولوژی پروتئین­های دارویی 1
2-1- کلون­کردن ژن 3
                         1-2-1- ابزار و عوامل کلون­کردن ژن 4
                                    1-1-2-1- آنزیم­های برشی 4
                                   2-1-2-1- آنزیم DNA لیگاز 5
                         2-2-1- وکتورهای کلونینگ 6
                                     1-2-2-1- پلاسمیدها 10
3-1- سیستم­های بیان کننده مورد استفاده در تولید پروتئین­های نو­ترکیب 11
                       1-3-1- باکتری E. coli بعنوان میزبان بیان کنندة پروتئین­های نو­ترکیب 15
                       2-3-1- وكتور بیان­كننده 15
                                    1-2-3-1- پروموتر 16
                                               1-1-2-3-1- پروموتر T7 و سیستم بیانی PET 17
                                    2-2-3-1- منشاء همانند­سازی 18
                                   3-2-3-1- ماركر انتخابی 18
                                    4-2-3-1- خاتمه دهنده رونویسی 19
                                    5-2-3-1- سیگنالهای ترجمه یكی از عوامل مؤثر در افزایش بیان 19
                                   6-2-3-1- انتخاب كدون 20
4-1- مسائلی در مورد تولید پروتئین­های نو­ترکیب در اشرشیاکلی 21
                        1-4-1- پایداری پلاسمید 21
                       2-4-1- عدم حذف متیونین در انتهای N ترمینال پروتئین نو­ترکیب 22
                        3-4-1- بار متابولیکی 23
                        4-4-1- مشکلات بیان پروتئین­های نوترکیب در سیتوپلاسم باکتری اشرشیاکلی. 23
5-1- سیستم ایمنی ذاتی و اكتسابی 25
6-1- سایتوکاین­ها 25
                        1-6-1- فاکتور نکروز کننده تومور (TNF) 26
                                     1-1-6-1- ویژگی­های ژن و مولكول TNFα 27
                                     2-1-6-1- ویژگی های ساختاری پروتئین TNF 28
                                     3-1-6-1- ساختار گیرنده TNF و سوپرفامیلی آنها 29
                                     4-1-6-1- نقش بیولوژیكی TNFα 31
                                     5-1-6-1- مكانیسم عمل 31
7-1- TNF-α و نقش آن در برخی از بیماری­های تحلیل عصبی 34
                       1-7-1- TNF و بیماری آلزایمر(AD) 34
                       2-7-1- TNF و ایسکمی مغزی 35
                       3-7-1- TNF و بیماری پارکینسون 36
 دستگاه­های مورد استفاده  
فصل دوم : مواد و روش­ها  
1-2- نمونه­گیری از خون انسان 38
2-2- استخراج ­RNAی كل از خون 38
             1-2-2- وسایل لازم 38
            2-2-2- روش کار 39
3-2- سنتز cDNA 40
                        1-3-2- روش کار 41
4-2- کلونینگ cDNA­ ی کد کننده TNF-α­ی انسان 41
                        1-4-2- طراحی جفت پرایمرها 41
                        2-4-2- واکنش PCR 42
                                     1-2-4-2- الكتروفورز با ژل آگاروز 43
                                        1-1-2-4-2- مواد و وسایل مورد نیاز 43
                                       2-1-2-4-2- روش کار 43
                                      3-1-2-4-2- رنگ­آمیزی ژل آگارز با اتیدیوم بروماید 43
                        3-4-2- خالص­سازی محصول PCR با بهره گرفتن از كیت 44
                       4-4-2- کلونینگ cDNA کد کننده TNF-α در وکتور pBR322 45
                                     1-4-4-2- انجام واکنش اتصال 47
                                     2-4-4-2- ترانسفورماسیون محصول اتصال به باکتری 47
                                     3-4-4-2- میزبان باکتریایی E. coli 47
                                     4-4-4-2- کشت و نگهداری باکتری­ها 48
                                      5-4-4-2- تهیه باكتریهای مستعد (Competent bacteria)

برای پذیرش DNA  پلاسمیدی خارجی

 

49

                              6-4-4-2- انتقال پلاسمید به درون سلول­های مستعد باکتریایی 50
                                7-4-4-2- غربال كردن كلون‌های واجد پلاسمید نو­تركیب و کشت کلونی باکتریایی. 50
                              8-4-4-2- استخراج DNA پلاسمیدی نو­ترکیب 51
                              9-4-4-2- تایید کلنی­های حاوی اینسرت توسط PCR و آنزیم­های برشی 51
                       5-4-2- كلونینگ cDN­ی كد­كننده TNF-α در حامل pET21 52
                                     1-5-4-2- برش حامل pET21 52
                                    2-5-4-2- اتصال ­cDNAی TNF-α به حامل pET21 54
                     6-4-2- انتقال پلاسمید نوترکیب به باكتریE.coli  سویه BL21(DH3) برای بررسی
پروتئین نوترکیب
54
                                   1-6-4-2- انتخاب کلون­های ترانسفورم شده و کشت کلنی­ها 54
5-2- روش­های مربوط به بررسی بیان پروتئین hTNFα نو­ترکیب 55
                        1-5-2- القاء بیان پروتئین نو­ترکیب 55
                        2-5-2- تهیه نمونه پروتئینی جهت SDS-PAGE 55
                                    1-2-5-2- SDS-PAGE 56
                                    2-2-5-2- مواد لازم جهت SDS-PAGE 57
                                    3-2-5-2- روش آزمایش 57
                       3-5-2- وسترن بلاتینگ 59
6-2- نرم­افزارها 61
فصل سوم : نتایج  
1-3- نمونه­های خون 62
2-3- استخراج RNA کل از خون 62
3-3- سنتز cDNA كل 63
                     1-3-3- تکثیر توالی کد­کننده cDNA فاکتور نکروز دهنده تومور آلفای انسانی 63
4-3- کلون­سازی توالی کد کننده cDNA فاکتور نکروز دهنده تومور آلفای انسانی تکثیر شده با روش PCR در پلاسمید pBR322 و ساخت پلاسمید نو­ترکیب pBRtnf  

 

64

5-3- ساخت پلاسمید بیان کننده نو­ترکیب pET21tnf 67
6-3- بررسی بیان پروتئین نو­ترکیب در E. coli 71
7-3- مقایسه اثر غلظت­های مختلف IPTG در میزان بیان پروتئین 72
8-3- بررسی میزان بیان پروتئین در زمان­های مختلف بعد از القاء 73
9-3- وسترن بلاتینگ 74
فصل چهارم : بحث  
4-1- بحث 75
فصل پنجم : نتیجه­گیری و پیشنهادات  
نتیجه­گیری و پیشنهادات 80
منابع مورد استفاده 81
فهرست جداول

عنوان

جدول 1-1 : برخی از پروتئین­های نو­ترکیب موجود در بازار دارویی………………………..3
جدول 2-1 : معایب و مزایای سیستم­های بیان کننده مختلف جهت تولید پروتئین­های نوترکیب…….12
جدول 3-1 : تعدادی از پروموترهای مورد استفاده برای بیان ژن در E. coli…………..17
جدول 1-2 :ترکیبات مورد نیاز در سنتز cDNA…………………………………………………40
جدول 2-2 : ترکیب واکنش PCR(مقادیر بر حسب میكرولیتر)……………………………..42
جدول 3-2 : واکنش برش آنزیمی………………………………………………………………………46
جدول 4-2 :  ترکیبات واکنش اتصال  TNF-αو pBR322………………………………..47
جدول 5-2 : فهرست سویه‌های E. coli استفاده شده در این تحقیق……………………..47
جدول 6-2 : ترکیبات محیط کشت LB……………………………………………………………..48
جدول 7-2 : مخلوط واكنش برای برش آنزیمی……………………………………………………54
جدول 8-2 : اجزای واكنش اتصال……………………………………………………………………..54
جدول 9-2 : تهیه 12 میلی­لیتر محلول ژل پایین با غلظت 10 در صد………………………57
جدول 10-2 : تهیه 5 میلی لیتر محلول ژل بالا با غلظت 4 در صد………………………….57
جدول 11-2 : ترکیبات بافر نمونه (5x)……………………………………………………………..57
جدول 12-2 : ترکیبات بافر الکترود (بافر مخازن)…………………………………………………57

 

فهرست اشكال
شکل 1-1 : اجزاء اولیه و اصلی وكتور بیان­كننده ژن در E. coli………………………………..16
شکل 2-1: نقشه كروموزوم MHC انسان و ژن hTNFα…………………………………………27
شکل 3-1 : ساختار كریستالی TNFα بر گرفته از Protein Data Bank………………..29
شکل 4-1 : شکل 4-1 مسیر سیگنالی TNFR1………………………………………………………33
شکل 1-2 : نقشه فیزیکی پلاسمید pBR322 (اقتباس از فرمنتاس)…………………………..46
شکل2-2 : نقشه فیزیکی پلاسمید pET21a (+) (اقتباس از فرمنتاس)………………………53
شكل 1-3 : چهار نمونه خون انسان سالم………………………………………………………………..62
شکل 2-3 : الکتروفورز RNA کل استخراج شده از 4 نمونه خون با بهره گرفتن از کیت……63
شکل 3-3 : الکتروفورز محصول تکثیر شده cDNA فاکتور نکروز دهنده تومور آلفای نو­ترکیب با روش PCR و با پرایمرهای R و F بر روی ژل آگارز………………………………..64
شکل 4-3 : نقشه پلاسمید نوترکیبpBR322tnf ………………………………………………….65
شکل 5-3 : الگوی برش نخورده پلاسمیدهای نو­ترکیب pBRtnf در مقایسه با pBR322 فاقد cDNA فاکتور نکروز دهنده تومور آلفا……………………………………………………………66
شکل 6-3 : الکتروفورز محصول واکنش PCR بر روی پلاسمیدهای نو­ترکیب بر روی ژل آگارز………67
شكل 7-3 : نقشه پلاسمید نوترکیب pET21tnf…………………………………………………….68
شکل8-3 : نتایج الکتروفورز محصول  PCRپلاسمید نو­ترکیب pETtnf با پرایمرهای R و F بر روی ژل آگارز…………………………………………………………………………………………………………………………………69
شکل 9-3 : الکتروفورز محصول پلاسمید نوترکیب pET21tnf برش یافته با آنزیم های NdeI، HindIII و بریده شده با دو آنزیم NdeI HindIIIبر روی ژل آگارز…………..70
شکل 10-3 : توالی نوکلئوتیدی ژن TNF و اسیدآمینه­ای ترجمه شده آن از یکی از کلون های نو­ترکیب به دست آمده، pET21tnf………………………………………………………71
شکل 11-3 : بیان ژن TNF-α انسانی در BL21 E. coli………………………………………72
شکل 12-3 : مقایسه غلظت­های مختلف IPTG بر روی بیان……………………………………73
شکل 13-3 : مقایسه بیان پروتئین در زمان­های مختلف بعد از القاء…………………………….73
شکل 14-3 : نتایج وسترن بلاتینگ بیان پروتئین نوترکیب در غلظت­های 0625/0، 125/0، 5/0و 1 میلی­مولار..74

علایم اختصاری:

LB: Luria Bertani

NK cell: Natural killer cell

OD: Optical Density

TNF: Tumor Necrosis Factors

TAE: Tris-acetate EDTA

SDS-PAGE: Sodium dodecyl sulfate polyacrylamid gel electrophoresis

RT-PCR: Reverse transcription polymerase chain reaction

rhTNF-α: Recombinant human Tumor Necrosis Factor alpha

MCS: Multiple cloning site

LPS: Lipopolysaccharide

IPTG: Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside

IL: Interleukin

INF: Interferon

EDTA: Ethylene diamine tetra acetic acid

DW: Distilled water

APS: Ammonium persulfate

MS: Multiple Sclerosis

TEMED: N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamine or N,N,N’,N’-Tetramethyl-1,2-diaminoethan

TE: Tris EDTA

TM: Melting temperature 

RCLB: Red Cell Lysis Buffer

CTL : Cytotoxic T cell

X-gal: bromo-chloro-indolyl-galactopyranoside

MHC: Major Histocompatibility Complex

AD: Alzheimer’s disease

PD: Parkinson’s disease

LT: Lymphotoxin

TLR: Toll-like receptor

FADD: Fas-Associated protein with Death Domain

RIP: Receptor Interacting Protein

 

 

 

 

 

چکیده

سایتوکاین ها خانواده ای از فاكتورهای رشد هستند که توسط سلول های سیستم ایمنی ترشح می شوند. این خانواده شامل اینترلوکین ها (IL)، اینترفرون ها (IFN)، فاکتور نکروز کننده تومور (TNF)، کموکاین ها و سایر فاکتورهای رشد می باشند. فاکتور نکروز کنندۀ تومور، بعنوان یك مولکولی با خصوصیات آنتی توموری است که عمدتاً توسط ماکروفاژهای تحریك شده با باکتری ترشح می شود. علیرغم ابنكه مقادیر محدودی TNF-α از منابع طبیعی آن بدست می آید اما مقادیر زیادی از فرم محلول آن (مورد نیاز برای مطالعات ساختاری و عملکردی) را می توان به آسانی توسط تکنولوژی DNA نوترکیب به دست آورد. بنابراین ترجیح داده می شود برای تولید این پروتئین نوترکیب از سیستم های ساده میكروبی و نیز گیاهان استفاده گردد.

در اینجا به منظور مطالعه بیان TNFα انسانی، cDNA کد کنندۀ hTNFα حاصل از RT-PCR ی mRNA سلول های ماکروفاژ انسان، با بهره گرفتن از پرایمرهای اختصاصی از قبل طراحی شده تکثیر گردید. محصول PCR خالص سازی شده، در سایت برشی EcoRV که در داخل ناحیه کد کننده مقاومت به تتراسایکلین در pBR322 بود، الحاق شد. سرانجام به منظور بیان، ژن هدف در پلاسمید  تحت کنترل سیگنال های رونویسی و ترجمه قوی پروموتور باکتریوفاژ T7 كلون گردید به این ترتیب كه وكتور نوتركیب و نیز هر دو با آنزیم های NdeI-HindIII بریده شده و قطعهDNA bp 478 حاصل از برش pBRtnf در pET21a(+) خطی شده، اتصال و سپس در E. coli DH5α ترانسفورم شد. پس از بررسی صحت کلونینگ (توسط تکنیک PCR و آنزیم های برشی) و توالی یابی قطعه کلون شده، بیان سیتوپلاسمی hTNFα نوترکیب در سویه BL21(DE3) E.coli از طریق تکنیک های  SDS-PAGEو نیز وسترن بلاتینگ مورد تایید قرار گرفت.

 


مقدمه

فاکتور نکروز کننده تومور آلفا (TNF-α) سایتوکاینی پیش التهابی است كه در راه اندازی و تنظیم سیستم ایمنی ذاتی و پاسخ های التهابی حاد در برابر باکتری های گرم منفی و سایر میکروب های بیماری زا از طریق فراخوانی نوتروفیلها و منوسیت ها به محل عفونت دخالت دارد. TNF-α برای اولین بار از سرم موش ها و خرگوشهایی که با سویه BCG مایکوباکتریوم بوویس یا آندوتوكسین باكتری ها تیمار شده بودند جداسازی شد كه در مرگ سلول های توموری نقش ایفاء می كرد. اگر چه وجه تسمیه این فاکتور به علت ویژگی های ضد توموری آن است اما این پلی پپتید 17 کیلودالتونی دارای عملكردهای متعددی نظیر دخالت در آپوپتوزیس، زنده ماندن سلول، التهاب، تنظیم خواب و رشد رویان می باشد.این فاكتور غالباً توسط ماکروفاژهای فعال، لنفوسیت هایT  ی CD4+، لنفوسیت هایT  ی CD8+، سلول های NK و ماست سل ها بیان می شوند. بیان آن در سلول های دیگر مانند فیبروبلاست ها، سلول های عضلات صاف و سلول های توموری پایین است.

TNF-α نوترکیب امروزه به طور گسترده در تحقیقات علوم پایه و بالینی و نیز به منظور درمان تومور مورد استفاده قرار می گیرد. لذا با توجه به اهمیت آن تولید و تخلیص TNF-α به شکل نوترکیب در موجودات پروكاریوتی در كشور می تواند باعث فراهم شدن زمینه جهت انجام تحقیقات بعدی نظیر تحقیقات ملکولی، پزشکی و بالینی بر روی این سایتوکاین مهم باشد. به علاوه امکان تولید آنتی بادی های منوکلونال و پلی کلونال برعلیه TNF-α که امروزه کاربردهای بسیار وسیعی در تشخیص و درمان بیماریهای مختلف دارند نیز فراهم می شود. از سوی دیگر با توجه به نقش ویژه TNF-α در مقابله با تومورهای سرطانی، تولید TNF نوترکیب می تواند دریچه ای نوین در برابر تحقیقات سرطان شناسی و نیز درمان تومورهای سرطانی فراروی محققین کشور بگشاید.

1-1-     بیوتکنولوژی پروتئین­های دارویی

بیوتکنولوژی (زیست فناوری)، مجموعه فنونی است که از سیستم زنده برای تولید یا تغییر فرآورده­های زیستی در جهت بهداشت و اقتصاد عمومی استفاده می­ کند(Wallman, 1997). گر­چه استفاده از میکروارگانیسم­ها برای تولید فرآورده­های زیستی دارای سابقه طولانی است ولی در زمینه بیوتکنولوژی مدرن امروزی نظیر تکنیک­های مهندسی ژنتیک و تکنولوژی  DNAنو­ترکیب، کاربرد فراوان دارند. اصطلاح بیوتکنولوژی نخستین بار در سال 1917 توسط کارل ارکی[1] به کار برده شد. در سال 1973 هربرت بویر[2] و استنلی کوهن[3] تکنولوژی DNA نو­ترکیب را ارائه دادند و در سال 1976 اولین شركت مستقل بیوتكنولوژی،­Genentech، به منظور تجاری كردن این تكنولوژی جدید تاسیس شد. در سال 1982 انسولین انسانی نو­ترکیب با بهره گرفتن از تكنولوژی DNA نوتركیب برای نخستین بار در E. coli به مرحله تولید رسید(Mckown and Coffman, 2002). پیش از بکار بردن روش های بیوتکنولوژی، تنها منبع تولید پروتئین­های دارویی منابع طبیعی آنها نظیر خون و بافت­های انسانی و حیوانی بود که اغلب به میزان بسیار اندک و با صرف هزینه بسیار بالا تهیه می­شد. همچنین به دلیل مشکل بودن روش های خالص سازی و از طرفی آلرژی­زا بودن پروتئین­های حیوانی برای انسان و امکان بروز اثرات جانبی، استفاده از این ترکیبات را محدود می­نمود(Brown, 2001). امروزه تکنولوژی DNA نو­ترکیب امکان آن را فراهم کرده است که بتوان cDNA کد کننده هر پروتئین را جدا کرده و به یک سیستم بیان کننده مناسب وارد کرد. در این حالت پروتئین مورد نظر در موجود بیگانه که اغلب یک میکروارگانیسم است،

 

 

بیان می­شود(Glick and Eds, 1998). به این ترتیب می­توان پروتئین­های دارویی را در مقیاس انبوه و بسیار ارزان­تر از روش­های قبلی تولید نمود(Walsh and Headon, 1994).

در حال حاضر بیش از 100 پروتئین دارویی نو­ترکیب برای درمان بیماری­های انسانی در بازار وجود دارد و در حدود 400 داروی جدید در درمان بیماری­های مختلف به ویژه سرطان، ایدز و ناراحتی­های دستگاه عصبی در مراحل کار آزمایی بالینی قرار دارند(Mckown and Coffman, 2002).

تکنولوژی دارویی مدرن از کلون کردن ژن و تکنولوژی DNA نوترکیب بهره می­گیرد. هدف نهایی بیوتکنولوژی دارویی ژن درمانی و ورود مواد ژنتیکی به سلول­ها برای جلوگیری یا کنترل و یا معالجه بیماری می­باشد(Ossege, Sindern et al., 1998). جدول 1-1 برخی از پروتئین­های دارویی تولید شده به صورت نو­ترکیب (T. A. Brown) را نشان می­دهد.

تعداد صفحه : 113

قیمت :14700 تومان

بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد

و در ضمن فایل خریداری شده به ایمیل شما ارسال می شود.

پشتیبانی سایت :        *       asa.goharii@gmail.com

در صورتی که مشکلی با پرداخت آنلاین دارید می توانید مبلغ مورد نظر برای هر فایل را کارت به کارت کرده و فایل درخواستی و اطلاعات واریز را به ایمیل ما ارسال کنید تا فایل را از طریق ایمیل دریافت کنید.